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标题:【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会

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发表于 2013-4-20 09:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚刚找到一个不错的网站
搜索基因中的稀有密码子：
cuturl('http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html')
挺不错的，正好借花献佛帖在这里。

查询结果：
< 2.0的只有一个“agg ”密码子，出现了7次；
还有最后的一个终止密码子uag，=0.2。
其他基本都是>5.0
这个大于、小于应该就是指稀有程度吧。

可是没找到关于如何确定蛋白毒性的。lz是如何查的？
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发表于 2013-4-20 09:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主：您的蛋白在哪里测序的？我在北京大学测序三次也未测出，每次原因都是N端封闭，而且是按照他们的建议制备的样品再测的。
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发表于 2013-4-20 09:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好,我遇到一个奇怪的问题:
我想纯化的是可溶蛋白,第一次纯化的时候蛋白在洗脱液elute buffer里(蛋白浓度高的几管里)出现了白色的絮状沉淀,跑了大胶准备割胶的,但是染色出来量不够,不知道什么原因,我又摇了一升菌准备再重复一次,但是纯化时又在柱子的上方形成了白色的絮状物,柱子堵得根本过不下来,过柱之前我用了12000转离了50分钟,然后又用0.45微米的滤器过滤,我想不应该是里面的渣滓太多的原因,请高手能帮我分析下原因吧,万分感谢!!!
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发表于 2013-4-20 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚刚找到一个不错的网站
搜索基因中的稀有密码子：
cuturl('http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html')
挺不错的，正好借花献佛帖在这里。

查询结果：
< 2.0的只有一个“agg ”密码子，出现了7次；
还有最后的一个终止密码子uag，=0.2。
其他基本都是>5.0
这个大于、小于应该就是指稀有程度吧。

可是没找到关于如何确定蛋白毒性的。lz是如何查的？

============================================================================================================

AGG编码Arg，该密码子是影响比较大的。
还有AUA, CUA, CCC也要注意。

另外，稀有密码子出现的位置也很重要，如果出现N端的cluster，可能导致不能表达。您可以查查相关文献。

是否毒性，可以通过在平板上比较克隆大小（与空载体对照比以及加或不加IPTG的进行比较）；也可以通过做生长曲线（处理同上）来进行比较。

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发表于 2013-4-20 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主：您的蛋白在哪里测序的？我在北京大学测序三次也未测出，每次原因都是N端封闭，而且是按照他们的建议制备的样品再测的。

===========================================

我只做了protein identification，没做N- sequencing
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发表于 2013-4-20 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好,我遇到一个奇怪的问题:
我想纯化的是可溶蛋白,第一次纯化的时候蛋白在洗脱液elute buffer里(蛋白浓度高的几管里)出现了白色的絮状沉淀,跑了大胶准备割胶的,但是染色出来量不够,不知道什么原因,我又摇了一升菌准备再重复一次,但是纯化时又在柱子的上方形成了白色的絮状物,柱子堵得根本过不下来,过柱之前我用了12000转离了50分钟,然后又用0.45微米的滤器过滤,我想不应该是里面的渣滓太多的原因,请高手能帮我分析下原因吧,万分感谢!!!

==============================================================================================================

您好，
关于您这个问题我想需要更多的detail，包括蛋白的pI和你用的buffer pH；什么column，column干不干净，elution buffer是什么成分等。也许我没办法给您建议，但相信会有人能给您有用的信息
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发表于 2013-4-20 09:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好!非常感谢你的回复!
我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9.
关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!
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发表于 2013-4-20 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

lz你好，我是个新手，看到了有关OD600的空白我想说下我的试验：我用空杯子和LB(1ml＋100ul甘油，甘油用于防止细菌在测OD值的过程中沉淀而引起误差)做了对照，同样我的样品也用1ml菌液＋100ul甘油，通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。不知用那种方法准一些，请高手指点
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发表于 2013-4-20 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，我还想问下：
我也在做原核表达，选用的BL21(DE3)菌珠，pGEX-4T3载体，amp抗性。蛋白表达量一直不高，而且我过夜培养（37度，180rpm）菌液抽提质粒时（博大泰克试剂盒）质粒浓度通常在100ug/ml，我把菌液诱导（37度，220rpm）到约OD＝0.4－0.6后，加氯霉素至终浓度85ug/ml，诱导过夜（37度，180rpm）后（OD=1.0）抽提质粒，浓度也只有160ug/ml，我在考虑是不是像lz所说，amp抗性的消失，造成了菌种选择压力的改变，致使无质粒的菌生长速度加快，而使质粒丢失造成的此现象，而质粒的拷贝数偏低，无质粒的菌存在又进一步影响了我的蛋白表达？
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发表于 2013-4-20 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好!非常感谢你的回复!
我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9.
关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!

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其它不好说，我觉得4M 咪唑应该高了点，虽然可能不是造成沉淀的原因；另外，2M NaCl是不是也高了些？请有经验的战友解答一下。

关于是否是变性的蛋白，可以用沉淀跑SDS-PAGE看看。
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