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标题:【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-20 09:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
lz你好，我是个新手，看到了有关OD600的空白我想说下我的试验：我用空杯子和LB(1ml＋100ul甘油，甘油用于防止细菌在测OD值的过程中沉淀而引起误差)做了对照，同样我的样品也用1ml菌液＋100ul甘油，通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。不知用那种方法准一些，请高手指点

=============================================================================================================

您好，
“通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。”没太懂这个问题。不过不管怎么样，我认为0.01 的误差不要紧的；

另外，加了甘油菌液就稀释了。从培养基里面取出菌液马上测，我认为菌体沉淀的问题可以忽略。加上每次你都是用一样的条件；而且对于菌液浓度来说，OD值并不需要非常精确。比如0.6-0.8，那么0.82或者0.84之间影响不大。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-4-20 09:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
受教!
也在做表达,很繁琐,经过两个月,摸爬滚打,好不容易做出了条带,但是还是在沉淀当中,上清中有但条带很淡,请教,高手如何提供可溶性表达.
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-4-20 09:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外我们通常用1:100稀释,效果不错,感时间的时候也用1:50.如果觉得培养时间长,重用培养基悬浮沉淀,可以去内酰氨酶
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发表于 2013-4-20 09:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一共配了5种Buffer,分别是Charge Buffer，Binding Buffer，Wash Buffer，Elute Buffer，Strip Buffer，ph都调到了7.9,也想到可能是ph的问题,但不知如何调节,更多的师兄师姐都说他们的ph7.9都做的很好,可能我的Buffer配错了,于是我干脆用别人的Buffer重复了一次,结果跟上次一样,细胞是在1*Binding Buffer里超声打碎的,然后离心取上清过柱子,样品在上清里面清澈透明挺好的,但是一加到柱子上方就出现很多白色絮状物,堵在柱床表面,样品滴的超慢,差不多1分半左右一滴,等的急死人了,柱子也是用1*Binding Buffer平衡好了的呀,如果是ph的问题的话,为什么不上柱子时挺好,而加到柱子上就出问题呢,谢谢各位的指点!!!
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发表于 2013-4-20 09:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，我还想问下：
我也在做原核表达，选用的BL21(DE3)菌珠，pGEX-4T3载体，amp抗性。蛋白表达量一直不高，而且我过夜培养（37度，180rpm）菌液抽提质粒时（博大泰克试剂盒）质粒浓度通常在100ug/ml，我把菌液诱导（37度，220rpm）到约OD＝0.4－0.6后，加氯霉素至终浓度85ug/ml，诱导过夜（37度，180rpm）后（OD=1.0）抽提质粒，浓度也只有160ug/ml，我在考虑是不是像lz所说，amp抗性的消失，造成了菌种选择压力的改变，致使无质粒的菌生长速度加快，而使质粒丢失造成的此现象，而质粒的拷贝数偏低，无质粒的菌存在又进一步影响了我的蛋白表达？

困惑ing...
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vcve[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于空白对照的问题，我个人认为，样品液和空白组差别除了目的物（菌OR、dna、ran等）外，应相同，这样才有可比性。关于甘油，我觉得还是看试验需求，如果一次测量多个样品，可以加，这样就损失了小部分但弥补了因菌沉淀而造成的误差，如果样品数量少或在测量前充分的重悬菌，就可以不加。
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发表于 2013-4-20 10:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想请教一下我连接后pet-22b-h-2kd比pet-22b跑的还快时怎么回事啊想请各位指点一下多谢了
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发表于 2013-4-20 10:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好!非常感谢你的回复!
我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9.
关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!

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根据你所说的情况，可以判断的是目标蛋白变性了。浓度高是一个原因，最主要的是缓冲体系的变化，这在蛋白表达后的下游处理中经常出现。建议你摸一下缓冲体系，pH适当调高，盐的浓度降低一些，并且加入一些表面活性剂，如0.1% tween20或TritonX100等，另外你的纯化是具有富集作用的，可以考虑适当稀释上样的样品浓度。good luck!
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发表于 2013-4-20 10:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有一个问题想向各位高手请教：我的蛋白表达了，但是测序公司给我的结果是第151位的碱基确实，其余碱基都对。我想知道PCR过程能导致移吗突变吗？再说移码了开放阅读框也不可能终止啊！请各位大侠赐教！
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有一个问题想向各位高手请教：我的蛋白表达了，但是测序公司给我的结果是第151位的碱基确实，其余碱基都对。我想知道PCR过程能导致移吗突变吗？再说移码了开放阅读框也不可能终止啊！请各位大侠赐教！

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PCR过程能导致碱基缺失；
移码了，如果导致正常（非突变）情况下之前的TAA，TGA或者TAG in frame了，就会造成提前终止。

当然测序也可能有错误。

建议您
1. 检查测序公司给你的峰图；
2. 检查是不是造成提前终止，如果终止了是否不能得到你现在的结果（也就是可能得到一个截短蛋白（要能根据分子量判断））；
3. 是不是两头测序的？
4. 重新做克隆。
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