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标题:【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会

windy+++[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有个问题想请教一下，我原核表达一个蛋白，带his标签，分子量应该45kd左右，发现上清中似乎有差不多大小的蛋白，但沉淀中有大量30kd左右的蛋白，请问大家认为是降解掉了，还是没翻译完全？
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yychen[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

节前做的wb和sds ，结果很郁闷
图是拿相机拍得
大家帮忙分析啊

用的protein marker 最上面的是98kd
我的目的蛋白是103kd+-

wb上的结果很奇怪，排除样品溢出。
page用的是wb胶的另外一半，所以没有marker，但是位置很高。大概就在胶破了的位置上。


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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近做绿色荧光蛋白（GFP）的表达和纯化，我的载体是经过改造的PET-15b(在多克隆位点加上了SmalI位点,因为我们这里大多做平端克隆），表达菌株是 BL21（DE3）。接种后37度至OD0.6-0.8后，加IPTG，37度诱导4小时。

电泳后有表达（上清和沉淀都有），但不是很大。但是纯化总是挂不上拄
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有个问题想请教一下，我原核表达一个蛋白，带his标签，分子量应该45kd左右，发现上清中似乎有差不多大小的蛋白，但沉淀中有大量30kd左右的蛋白，请问大家认为是降解掉了，还是没翻译完全？

==========================================================

即使不带任何质粒的BL21 DE3，沉淀中也是有蛋白的，所以还是要有对照
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚开始做，有个问题，SDS loading buffer裂解全菌，超声10min，然后煮沸5min，离心后发现有大量不溶物，上清上样跑SDS-PAGE，用anti-His抗体做westernblot ，结果发现未经IPTG诱导就有很强的条带，分子量是make sense的，但是IPTG诱导后反而条带消失了，这是怎么回事？是不是蛋白在沉淀里呢？这个不溶于SDS的沉淀该怎么处理来上样跑胶阿？！ 谢谢！


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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大侠，你好

我现在做大肠杆菌的正交优化表达，发现经过单因子实验得到的水平数正交实验后，有些培养基根本不表达，跑电泳都没有目的条带，请问这是什么原因啊

谢谢
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发表于 2013-4-20 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，您好！
我最近在原核表达一种蛋白，用的是novagen公司的pet-32a(+)载体，LB培养基，BL21表达菌。空载体能诱导出蛋白来，可是重组好的怎么也诱导不出来，我摸过温度25-37度，诱导时间6h-12h,IPTG浓度0.01-10mM 还有诱导前菌液的OD600值，可是就是不出目的蛋白，快急死我了！！
难道与我的目的蛋白有关吗？还是其他什么因素？我怎么才能知道我的目的蛋白有毒性或是培养基里需要某种成分有助于它表达呢？
急切盼望版主的指点迷津！
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发表于 2013-4-20 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
空载体有蛋白，诱导系统应该没有问题；
我认为需要check的东西有，
1. 稀有密码子的问题，
2. 是否有毒性，你可以划一个有IPTG的板子，看看生长情况即可，当然也可一通过OD来看，不过前者更简单直接；
3. “诱导不出来”是一个结论。您是如何得出这个结论的，写详细一些可能更能得到有效的应助。
个人意见，供您参考。
Bless
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发表于 2013-4-20 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢版主的指点，我核对了一下我的目的蛋白的序列长约860Bp，发现共有十四个稀有密码子，第一个就是稀有密码子ATA，是不是这会有影响？我的目的蛋白里PCR时没合成起始密码子，和载体的N端标签融合只要不发生移码不需要起始码也可以吗？
我所说的“没诱导出来”是相对未诱导对照菌（没加IPTG）来说的
还有假如我的蛋白有毒性加入IPTG后划盘子是不是不长菌？
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Ao7[使用道具]
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发表于 2013-4-20 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

太好了，您在呢，版主
还有我的目的蛋白是外分泌蛋白，为了防止它分泌到培养基里不好收蛋白，所以我在PCR时没有合成它的信号肽序列，以前我师姐曾作过它的含有信号肽的但在培养基里也没有收到蛋白
“加入后划盘子”应是 "划含有IPTG的平板"
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