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标题:HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈

maicaixiaogu[使用道具]
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发表于 2009-11-27 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈

一些很好的经验，对论坛以及自己的一些经验进行了总结，希望能对大家有所帮助。

　　HPLC使用注意事项

　　1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜 过滤)。

　　2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

　　3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

　　4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲 洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

　　5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

　　6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

　　7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

　　8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清洗方法;①以异 丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清 洗;⑧用10%稀硝酸清洗。

　　9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

　　10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。

　　11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

　　12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

　　高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状 可能的原因 解 决 方 法

　　(一)保留时间变化

　　1.柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱

　　2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

　　3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L的缓冲液

　　4.柱污染 每天冲洗柱

　　5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相

　　6.柱快达到寿命 采用保护柱

　　(二)保留时间缩短

　　1.流速增加 检查泵,重新设定流速

　　2.样品超载 降低样品量

　　3.键合相流失 流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向

　　4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀

　　5.温度增加 柱恒温

　　(三)保留时间延长

　　1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡

　　2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化

　　3.键合相流失 同前(二)3

　　4.流动相组成变化 同前(二)4

　　5.温度降低 同前(二)5

　　(四) 出现肩峰或分*


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[ 本帖最后由 maicaixiaogu 于 2009-11-27 10:48 编辑 ]
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maicaixiaogu[使用道具]
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发表于 2009-11-27 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
　　液相色谱柱使用经验谈

　　色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

　　1、样品的前处理：

　　a、最好使用流动相溶解样品。

　　b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

　　c、使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。

　　2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流

　　动相具备以下的特点：

　　a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

　　b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

　　c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

　　d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

　　e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

　　f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

　　2、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

　　注意：

　　a.由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

　　b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

　　c.含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

　　d.流动相要求使用0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。

　　e.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能

　　HPLC的常用术语

　　第一部分　色谱曲线

　　1、 romatogram)：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通色谱图(ch过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。

　　2、 (色谱)峰(chromatographic peak)：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。 此主题相关图片如下： 此主题相关图片如下：

　　3、峰底(peak base)：峰的起点与终点之间的连接的直线(图1 中的CD)。

　　4、峰高(h ，peak height)：色谱峰最大值点到峰底的距离(图1 中的BE)。

　　5、峰宽(W ，peak width)：在峰两侧拐点(图1 中的F ，G)处所作切线与峰底相交两点的距离(图 1 中的KL)。

　　6、半高峰宽(W h/2 ，peak withd at half height)：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直 线 与峰两侧相交两点之间的距离(图1 中的HJ)。

　　7、峰面积(A ，peak area)：峰与峰底之间的面积(图1中的CHEJDC)。

　　8、拖尾峰(tailing peak)：后沿较前沿平缓的不对称的峰。

　　9、前伸峰(leading peak)：前沿较后沿平缓的不对称的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)

　　10、假峰(ghost peak)：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。(又叫鬼峰)

　　11、畸峰(distrorted peak)：形状不对称的色谱峰， 前伸峰、拖尾峰都属于这类。

　　12、反峰(negative peak)：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。

　　柱的使用和维护注意事项(推荐)

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maicaixiaogu[使用道具]
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发表于 2009-11-27 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程

　　高效液相色谱仪操作步骤：


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yfdihdx[使用道具]
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 小中大
感谢分享！收获很大！！
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 小中大
总结的很好，使我收获很大，谢谢了
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huihuidetian112[使用道具]
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 小中大
不错的资源，够实用的。。
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aasle[使用道具]
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 小中大
十分感谢分享好文，确实很不错。
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lfm20091102[使用道具]
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发表于 2009-11-27 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
:) :)
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gitde[使用道具]
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发表于 2009-11-27 11:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您的文章很实用！ 学习了。。
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发表于 2009-11-27 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哈哈，不错的好东西，谢谢楼主！
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