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标题:【讨论帖】western 内参选择

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做了半年的western,就我对内参的理解如下
1.所选内参有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些细胞的基本结构蛋白或是管家蛋白,细胞表达稳定,且表达水平高,在同一种类的细胞上表达基本一致.
2.做内参可以:一,检验你的整套western装置是否正常run effectively.包括你的配液,你的胶以及电泳和转移,一抗的效价以及显色等.二检测你的样品蛋白含量是否相等.
3.选择内参要根据你的目的蛋白的性质即你的 目的蛋白是胞内还是核内,你蛋白的 分子量是大是小,当然还有价钱以及你的目的.
4.一般内参是比较容易作出来的,同时它也是帮助你摸索条件的,你把其做漂亮,你后面就很顺利了,只是转移的条件有点变化.其余照样或根据说明书操作.
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请问一下如果内参和目的蛋白的差距很大，比如我的目的蛋白是一百多ＫＤ，可是常用的内参都是３０～５０ＫＤ，是不是一定要分块胶来跑呢？
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wsll[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那么，我想请教一下用过β-actin做内参的朋友，有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况？当然前提是：1，我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白，且检测到了我的目的条带。2，用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。
也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。cuturl('http://www.beyotime.com/aa128.htm') 具体什么原因造成这种情况，我也不想太麻烦去搜了，还请知道的战友指教。同时也算是给朋友们提个醒吧。

另，我曾用GAPDH抗体死活也检测不到小鼠肺组织的条带，由于这个做的时间比较早了，不知道是抗体原因还是我WB的原因还是其他原因，不得而知。仅供朋友们一个参考吧。
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有个弱弱的问题想请教一下：β－actin与α－tubulin的主要区别是什么，在肌组织与上皮组织间表达是否相同？
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hold住[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么问题?谢谢!
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 hold住 于 2013-4-20 16:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么问题?谢谢!

会担心有影响。
保险一点，还是分别孵育。
你的目的蛋白 和内参 分子量相差多少呢，如果相差比较大，你可以把2者剪开，分别孵育一抗。
如果分子量太相近了，还是先孵育目的蛋白一抗，重新封闭，再孵育内参一抗。
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发表于 2013-4-20 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
GAPDH： glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease （甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶。
因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样品与样品之间的比较。
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GAPDH检测。Western Blotting(检测条带大约在36kDa，稀释比例达10，000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。


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quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图示:抗GAPDH单抗（Cat＃KC-5G4）检测心脏组织匀浆中的GAPDH水平。A-G分别表示不同实验来源的心脏组织匀浆。抗GAPDH单抗稀释比例为1：10，000，HRP羊抗鼠二抗（Cat＃KC-MM-1302）稀释比例为1：1000。采用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit试剂盒及X胶片曝光显影。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-4-20 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么问题?谢谢!

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也是新手，不过个人为只要目的蛋白和内参的分子量差距足够大当ECL显色时两条带就不会相互干扰，可以同时孵育，一抗二抗均可同时孵育。因为我们用的都是特异性抗体，混合孵育从技术上是没问题的。也有很多人在这样做，也有很好的结果。
从经济的角度考虑，剪膜、分开孵育，一抗4度过夜，这样一抗可以重复利用有时可重复2-3个月。
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