蛋白质与蛋白组学

我觉得： 抗原表位有线性（氨基酸序列的不同）和构象型（空间结构的不同）两种，如果你的抗体识别的是构象型的表位，你做western时蛋白要变性，其构想结构破坏，导致抗体抗原不能识别结合，因而也会做不出结果；如果是线性表位则天然的和蛋白变性后这种表位都存在，抗体抗原可以继续结合。你要查询有关资料，排除一下是否是此原因所致。

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谢谢楼上指教。您说的很对，单克隆抗体的确可能存在这样的问题，但可能还不是主要原因。

查了一下actin（肌动蛋白）：“脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。”－－－－－－cuturl('http://baike.baidu.com/view/32327.htm')

β-actin抗体检测不到心肌和骨骼肌的条带，大概是这个原因吧。

查了一下actin（肌动蛋白）：“脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。”－－－－－－cuturl('http://baike.baidu.com/view/32327.htm')
β-actin抗体检测不到心肌和骨骼肌的条带，大概是这个原因吧。

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不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响的
所以买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白。
很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。

就比如我上次买了个抗体，说明书上写着检测的smooth muscle isoform的，因为我的细胞激活后具备的就是平滑肌表型，所以就买了。
买来后一直不出条带，我纳闷了，于是提取大鼠主动脉组织作为对照，也不出条带。火了，就用了另外个细胞株做对照，条带就出来了，而且很亮，压片时能见到荧光，但是我的细胞和大鼠主动脉组织就是没有条带。
后来又做了几次，大鼠主动脉组织也出过两次条带，但是非常细非常淡，若有若无那种，提高上样量也是这样，以致于根本不能扫描，
此公司做抗体是用的是一段合成肽，我比较了两种异构体，只有6，7个AA的差异，
我自己的解释是，这个抗体应该针对的是非平滑肌isoform，但非常小的程度上也能检测到smooth muscle isoform。
目前正在与此公司交涉。

不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响的
所以买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白。
很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。

就比如我上次买了个抗体，说明书上写着检测的smooth muscle isoform的，因为我的细胞激活后具备的就是平滑肌表型，所以就买了。
买来后一直不出条带，我纳闷了，于是提取大鼠主动脉组织作为对照，也不出条带。火了，就用了另外个细胞株做对照，条带就出来了，而且很亮，压片时能见到荧光，但是我的细胞和大鼠主动脉组织就是没有条带。
后来又做了几次，大鼠主动脉组织也出过两次条带，但是非常细非常淡，若有若无那种，提高上样量也是这样，以致于根本不能扫描，
此公司做抗体是用的是一段合成肽，我比较了两种异构体，只有6，7个AA的差异，
我自己的解释是，这个抗体应该针对的是非平滑肌isoform，但非常小的程度上也能检测到smooth muscle isoform。
目前正在与此公司交涉。

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是得好好跟公司说道说道了。

我也在怀疑是公司选用了不合适的抗原片段来制备β-actin抗体（或者，我选用了不合适的抗体），以至于检测产生组织特异性。因为，1，actin几种异构体的确存在组织分布特异性，β-actin分布于非肌细胞中作为骨架蛋白；2，actin几种异构体的氨基酸序列具有较高的相似性（>90%）；3，β-actin要作为内参，得首先保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）。那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列。

问题是我的抗体太久了，查不到是哪个公司的了。这两天有些忙，凑空我再查查公司β-actin抗体的相关信息吧。

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补充β-actin抗体的一些信息：
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肌动蛋白（actin）是一种重要的骨架蛋白，目前在动物细胞中发现至少有6种亚型存在：“Nonmuscle beta- and gamma-actin, also known as cytoplasmic actin, are predominantly expressed in nonmuscle cells, controling cell structure and motility. alpha-cardiac and alpha-skeletal actin are expressed in striated cardiac and skeletal muscles, respectively; two smooth muscle actins, alpha- and gamma-actin, are found primarily in vascular smooth muscle and enteric smooth muscle, respectively. ”
因此,理论上,特异性针对beta-actin的抗体必然在心肌和横纹肌中检测不到条带.但实际上,因为存在如下问题:
1,不同型actin之间具有较高的序列相似性(>90%).
2,公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原.
因此,可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如,选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测Nonmuscle 细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除Nonmuscle细胞外,还可以检测cardiac,skeletal,smooth muscle细胞的actin.

实际上,公司所制备的beta-actin抗体确实存在上述情况.
1, 选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗).这类的抗体占大多数,主要有santa cruz(sc-69879),sigma(A1978等),ProSci(Catalog No.: 3779),Cell Signaling(#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等。这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。
相关网址如下：
cuturl('http://www.cellsignal.com/products/4967.html')
cuturl('http://www.scbt.com/datasheet-69879-beta-actin-ac-15-antibody.html')
cuturl('https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/A1978')
cuturl('http://www.prosci-inc.com/Antibody-TDS/3779%20B-actin.html')
cuturl('http://www.axxora.com/actin-related_products-BET-A300-491/opfa.1.1.BET-A300-491.1916.4.1.html')

2, 选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体。主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).
相关网址如下:
cuturl('http://www.axxora.com/actin-related_products-PSC-3777/opfa.1.1.PSC-3777.1301.4.1.html')
cuturl('http://www.epitomics.com/products/1784-1.php')
cuturl('http://www.epitomics.com/products/1854-1.php')
这类抗体便可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号.

最为明显的区分可以见Cell Signaling公司和EPITOMICS公司免疫组化的结果(顺请wxq2005fw指教):
cuturl('http://www.cellsignal.com/products/4967.html')
cuturl('http://www.epitomics.com/products/1854-1.php')

也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。cuturl('http://www.beyotime.com/aa128.htm') 具体什么原因造成这种情况，我也不想太麻烦去搜了，还请知道的战友指教。同时也算是给朋友们提个醒吧。

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这句话非常值得商榷。

你的这个问题还是很好解决的，
做个对照，
用平滑肌组织，骨骼肌组织，心肌组织，肝组织或其他的在同一张膜上杂一次。
看看条带出的情况如何。