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标题:【讨论帖】western 内参选择

Ao7[使用道具]
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可供选择的内参除了前面说过的actin和tubulin,还有Ubquitin,elgf等。但是,最重要的是一定要确定试验的处理因素不会对选择的内参蛋白表达产生影响,比如常用的tubulin,可能就不太适合用来定量有丝分裂相期的蛋白表达情况。因此,如果有条件,最好在预实验中平衡比较一下多种内参再选择最优。当然,对于我们大多数人来说,只要回顾一下本研究领域的权威参考文献,大概就可以确定哪种内参在这种实验中已经得到公认了!
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ritou1985[使用道具]
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请问细胞外基质蛋白(把细胞EDTA移除后剩下的部分) 用什么做内参呀?
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DNA[使用道具]
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关于内参的应用问题,国内一直还没有形成应用的习惯,可能是有研究水平的原因,也有可能是内参的抗体大部分是国外产的,超级贵!前段时间为了一篇文章,用的内参外国人老不相信,老板一狠心买了两只chemicon内参,50ug包装,每支3000多!不过好在我们有自己做的一支很好用的内参单抗,平常的实验可以保证敞开用,国内其他大部分实验室可能就没这么好的运气了!但是老板经过此事也下决心要把这个抗体完整详细的鉴定出来,然后推出去让大家都来用提高它的可信度。目前,鉴定的工作已经差不多完成了,剩下的就是申请专利,不管最后是怎么卖出去,国产的东西应该会大大便宜于国外的,这对大家来说可能也算一个好消息吧
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最近做western blot,样品:1:鼠的肝脏组织;2-4是人的脑肿瘤细胞。但是样品1的beta-actin 总是比其他的样品表达低。请问做鼠的肝脏组织WB,是不是不能用beta-actin 做内参啊?那应该用什么呢?GAPDH可以吗?看一篇文章用的是GRB2。多谢!
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911[使用道具]
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上面说的都是细胞的总蛋白。如果是核抽提物该用什么做内参呢?好像有用组蛋白的,不是太清楚
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quiqui008[使用道具]
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最近做western blot,样品:1:鼠的肝脏组织;2-4是人的脑肿瘤细胞。但是样品1的beta-actin 总是比其他的样品表达低。请问做鼠的肝脏组织WB,是不是不能用beta-actin 做内参啊?那应该用什么呢?GAPDH可以吗?看一篇文章用的是GRB2。多谢!

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你好,小鼠肝脏组织的beta-actin我做过的,完全没问题的.你的肝脏条带比较淡,可能是你提取的蛋白浓度较低或上样量较低造成,组织总蛋白的提取相对比细胞稍微困难些,你再试试其它的蛋白提取方式或裂解液?
祝好运!

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quiqui008[使用道具]
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核抽提物可以选用一些核内相对稳定表达的蛋白作为内参,如组蛋白,PCNA,lamin蛋白等.核内蛋白内参的选择同样要遵循细胞总蛋白内参的选择原则,即对样品的处理方式不会影响到内参的变化.比如,若检测DNA损伤因素对蛋白的影响,PCNA最好是不要用的.
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quiqui008[使用道具]
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我来说点不同看法
内参是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案显然是否定的.只有在需要得到可发表的结果的情况下,才有必要做一个漂亮的内参.

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这么肯定的将内参的作用局限在“需要得到可发表的结果的情况下”的狭小范围内,似乎有些不妥。科研过程中,有谁能未卜先知到实验结果?没有内参的作用,我们如何得知得到的结果就是“可发表的结果”?

1: western本身就是一个很粗略的定量方法,严格的说,根本不具有定量的能力,所有从werster里出来的表达量的区别(明显的“有”“没有”的区别属于定性),都是不精确的,苛刻点说,压根就是不可采信的。所以内参只是一个为了结果完整性而出现的东西,平时做western如果次次做内参,完全没有必要,也没什么太大帮助

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western的确是一种半定量的方式,不是很精确,但这决不是因噎废食甚至是“破罐子破摔”的理由。内参的出现,就是为了在一定程度上弥补WB的不足而必须的一种实验设计,只有这样我们才有可能对每次的WB结果进行分析。请注意,内参不是完整性结果的“果”或“附属品”,而是“因”或“前提”,颠倒了两者的关系,可不是一种科学严谨的实验态度哦。
当然,如果是同一批样品,在保证上样体积一致的情况下,是可以不必次次做内参的。
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quiqui008[使用道具]
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2: 那么如何控制上样量,有很多办法,可以通过SDS-PAGE粗略判定,这个方法一点不比用内参差,那些abundant protein在胶上完全可以通过肉眼辨别条带的深浅,反倒是用western判断很困难,在western结果出来都是很黑的条带,不一定在胶上看起来就一样. 而最直接的办法是在准备sample的时候就下好功夫,取多少个细胞,最终溶解在多少sample buffer里面,是可以控制出load的时候每条lane大概有多少细胞的.

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WB结果出来很深的条带,那是因为曝光时间太长的缘故,可以适当减少曝光时间或通过其它有效方法来降低条带的亮度,这样之后还是能够很容易在胶片上判别的。条带的亮度与上样量并不是一直都是线形关系的,不仅WB如此,考马斯亮蓝染色也是如此。SDS-PAGE上的丰度蛋白本身就具有很多不确定性,比起已知的内参,利用其作为判定标准更在无形中增加了判断误差的风险。
比较认同您关于“准备样品时下好功夫”的观点,不仅仅是可以尽量保证总蛋白量的一致,更重要的是良好的蛋白样品会有好的电泳行为,直接影响到WB条带的质量。即便如此,每次准备样品后,内参还是要有的。
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