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标题:【讨论帖】western 内参选择

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-4-23 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参，尤其是werstern的内参，绝大多数情况是作为“漂亮的马后炮”出现的,当你前期控制完之后，再放上一个内参告诉别人“看，的确如我所料”.

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“漂亮的马后炮”，我们的确也常在茶余饭后这样调侃内参的作用。但在实验中，它的确是我们评价实验结果的“基石”，只有这样，我们才能理直气壮的指着内参告诉别人，“看，的确如我所料”。
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-4-23 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是大鼠肺组织,提取的是总蛋白,转胶100V,两个小时,用B-tubilin抗体,两个公司的均未出结果,昨天换了B-actin,也没有出结果.目的条带出过,请教一下大家.
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蒲公英[使用道具]
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发表于 2013-4-23 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做内参的目的是为了保证蛋白上样量相近/相等..
仔细想一下到底有多少实验需要相对精确的上样量就知道了,其实并没有太多.
1: 如果你是为了做kinetic assey之类的,那么蛋白量是需要相当的精确,靠WB的内参显然是远远不够的

2: 如果是为了detect到不同sample蛋白量的区分,那是需要并且如果想发表,结果中是必定要有内参的.但是,依然有精确度的问题. 倘若变化范围很小,光靠内参有说服力么?还是要回到更精确的蛋白定量上去;而倘若范围变化很大,例如RNAi之类的,又需要用到内参这样相对"精确"的方法么? SDSPAGE甚至sample制备的时候做的一些控制已经绰绰有余了.

3: 还有一个是顺序问题,请问有哪个人在做RNAi screening之类实验的时候,每个sample做内参的?都是挑好clone了之后想做个发表结果的图的时候才放上内参的吧.否则先不谈浪费antibody的问题,光是花掉的时间和获得的效果,有性价比么?很多人做fusion protein detection的时候甚至连SDS-PAGE都省了,直接上DOT BLOT(一般买的tag antibody质量都很好). 内参用在一些"关键性"的情况下才有意义.并且这个范围还很狭小,既不能太小(内参不够精确),也不能太大(SDSPAGE可以做到同样效果).

4: 至于LS某人提到的习惯问题,我只想说..国外好象也没听过WB次次用内参的,这个和科研水平高低毫无关系,因地制宜吧,不用这么死板.
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987789[使用道具]
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发表于 2013-4-23 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

嗯,受教了.在大量筛选的情况下,要求都加上内参,的确近乎苛刻.(只是不知道,不加内参的筛选,意义何在.保留意见吧,或许是我太苛刻了?呵呵)
感谢楼主的指教!
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发表于 2013-4-23 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上面说的都是细胞的总蛋白。如果是核抽提物该用什么做内参呢？好像有用组蛋白的，不是太清楚

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我们做的是核蛋白抽提中的蛋白，用的GAPDH做内参，因为我们的目的条带与beta－actin比较接近，所以没用bata-actin，选了GAPDH，实事证明GAPDH可以用，而且好用。bata-actin因为没有自己试过，所以不敢随便说，但是决定应该是可以的。另外建议内参最好选用有标记的内参，如辣过氧根标记的GAPDH这样做起来比较方便。
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发表于 2013-4-23 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

WB常用内参及其技术参数

内参名称 分子量大小 适用范围
beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞
GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞
Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞
VCDA1/Porin 31kDa 线粒体
COXIV 16kDa 线粒体
TBP 38kDa 细胞核
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发表于 2013-4-23 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做心肌细胞，内参可以选择B-actin吗
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发表于 2013-4-23 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想请教下，在线粒体中做出了ＧＡＰＤＨ，是否属于异常呢，能否作为线粒体的内参?

请高手指点，非常感谢！
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发表于 2013-4-23 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

内参的抗体与二抗的种属重要吗?例如内参的抗体是鼠抗兔的,二抗是不是要是抗鼠的?
本人的一抗是兔抗人的,内参的抗体是鼠抗兔的,二抗是羊抗兔的,内参怎么都做不出来,但使用羊抗鼠的二抗做内参很明显,郁闷中
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-4-23 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
癫痫
我作2-D电泳筛出来的蛋白里面，actin和GAPDH都有差异表达，请问这种情况下，还能选择这两个蛋白做内参吗？（我是做的癫痫脑组织的蛋白质组学）
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