小中大 1 制备用的流动相最好等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。
2使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算精确，检测器的响应时间设到最小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1* (9.4/4.6)2, 大约为4ml/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5ug，显然浓度太低，最好是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。
3 问： 我想用hplc分离一个简单的多肽,我应该选用什么样的流动相,还有他的梯度,还有选用什么样的柱子
答：
RP-HPLC,C18柱可以制备很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先应该用同类型的分析柱子分析一下多肽含多少杂质，设置缓缓的梯度的分离样品，在根据分析柱子跑出的峰形，逐渐放大纯化的方法。
4 问：TFA在缓冲液中是不是只起到调节pH的作用呢?TFA的浓度越高基线的漂移越厉害，那是不是说它的浓度在缓冲液pH允许的情况下越低越好呢?
答：
(1)TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。
(2)同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。
(3)走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。
5 问：样品如果溶解度太低如何上制备HPLC?
答： [云帆]
(1) 了解一下样品的性质,根据其酸碱性,极性等性质，通过调节溶剂的pH值等, 以达到较好的溶解度
(2)样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂(如丙酮等)以助溶。
(3)不是一定要用流动相来溶解样品，对溶解度差的样品，可以选择甲醇，THF或DMSO等溶解样品。特别是DMSO，对一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不会造成干扰。而且DMSO的洗脱能力很弱，一般不会影响峰型。
(4) 可以固体上样。
6 问：多肽的分离制备, 如何上量?如何增大分离度?
答： [888wym]
反相HPLC应当是很好的分离小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O(95：5)做流动相，看保留如何，若无保留，建议改用其他色谱方法进行分离。
关于多肽的分离，首先要知道它的分子量大小，然后选择不同类型的填料，如孔径的大小。我们先在分析柱(4.6MM内径)上做一下实验,找到最大的分离度,这一过程的难度是最大的,要不断地改变流动相和固定相,然后再线性或非线性放大到制备,放大的倍数按分析柱的实验结果。分离后可以通过冷冻干燥得到固体。
还可以考虑离子交换来分l离
7 问： 做柱层析时(国产大孔吸附树脂)，怎么才能把洗脱液中的树脂残留物处理干净?
答： [郭峰]
大孔吸附树脂在上使用前，一般需要进行处理，方法包括用色谱纯的甲醇或乙睛洗到没有吸收;或树脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常规的酸，碱洗。再用丙酮回流二小时就可以用了。
8 问：由分析型液相转为制备型液相，其色谱系统需作多大调整?是否可以按照柱体积折算只改变流速?其上样量多大为宜?
答：
(1)泵要换，流量要加大，压力可不变或减少;流通池要换体积更大的。
(2)整个系统的管路要更换更粗的，否则压力太大,而且特别容易发生堵塞。对流通池后的管路，最好增加反压调节器，否则管路太短的话，反压小会导致流通池气泡，管路长的话会导致峰展宽。
(3)检测器的响应时间和峰宽要设置合适，否则会导致收集时延迟体积的计算不准
(4)上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度、制备是否根据分析条件放大(例如制备柱是否还用分析用填料);一般上样量与柱子直径的平方以及长度成正比。
9 问：流动相中含有盐时，收集液该如何除盐?选用挥发性酸，碱或盐(如醋酸铵)是否会在挥干溶剂或冻干过程中直接除去?
答： [半透膜]
一般可以采用离子吸附的办法去掉(可以参考离子吸附有关技术)。但也是稍微麻烦的事情，最好，不加加酸碱盐，如果要加的话最好，要加挥发性的或者对产品或者检测没有干扰的。
可用G25脱盐，它是安马西亚出的葡聚糖凝胶。交联度大孔径小,对小分子的无机盐保留较大,而对分子量较大的有机物没有保留从而可以将盐份脱除。另外采用挥发性的酸，碱时，一般会在干燥过程中直接除去，但如果样品也有酸碱性，可能会与这些挥发性酸碱形成一定比例的盐。
10 问：制备型柱子柱压上升 柱效下降 怎么办?
答： [wu_pass]
对高价值的制备柱来讲，延长柱子寿命是很重要的。一般要注意保护柱子，一般来说，制备柱子一般需要保护柱配套。
下面是可能堵塞柱子的原因
(1) 如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤(0.45微米)，一些颗粒性杂质会积聚在柱头造成柱压升高，
(2) 也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因，结晶或发生化学变化而堵塞。可以把柱子冲一冲。
(3) 流动相是否符合液相色谱的要求?是否过滤处理?
柱子再生处理办法如下：
(1)依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。
(2)如果效果不明显，将柱子按以上顺序反冲，一般将大大降低柱子效果，不到不要没有办法才采用。
(3)如果效果还是不好，就需要打开色谱柱，超声波清洗筛片(这样也会使柱子效果下降)。必要时挖掉色谱柱内受污染部位，填入新的填料，还可用3个月。(填的时候小心，别重新污染柱子)
