小中大Ⅸ)从沉Ⅲ中纯化溶酶体及线粒体:
配制溶液:0.3M,1.1M,2.1M蔗糖分别溶入1Mm edta与5mM Tris-HCL(PH7.0)
在14ml PC管中制备好二个10ml, 1.1M,2.1M蔗糖的线性梯度可以用梯度形成仪做成,也可以用不连续梯度(1.1M,1.4M,1.7M,2.1M,每种2.5ml)在5℃静置12~16小时也会形成连续的1.1~2.1M近线性梯度。
在沉Ⅲ中加入10ml,0.3M蔗糖液,轻摇,慢慢地可以看到离心管底部沉积了暗褐色的沉淀(溶酶体)倒去上清,加入4ml 0.3M蔗糖液在匀浆器中磨匀(注意:活塞与器壁要松一些)。取2ml以上匀浆置于线性梯度(1.1M~2.1M蔗糖)之上,轻搅匀浆使其与梯度液之间的界面尽可能减少密度的不连续,在甩平转头中95000g,5℃离心4小时。
离心后,溶酶体区带形成于1.20~1.26 g/cm3密度之间(在离心管下部)而线粒体则形成于1.17~1.21g/cm3密度之间(在离心管中部。溶酶体区带中密度较高的部份相对较纯。
Ⅹ)从沉Ⅱ及沉Ⅲ中纯化高尔基膜:
配置梯度溶液:38.79,36%,33%,29%(w/w)蔗糖液每种均加入5mM Tris-HCL(PH8.0)
用上清Ⅰ离心,10000g,5℃ 20分钟待到沉Ⅱ+沉Ⅲ
用5ml 0.25M蔗糖,5mM Tris-HCL(PH8.0)稀释沉淀,恒湿搅拌并使溶液的蔗糖浓度上升到43.07%(w/w),用光折射仪检测(5℃,1.1979;20℃,1.1957)
在PC离心管中(13ml)由下往上依次铺设如下层次:
3ml样品(蔗糖浓度43%w/w),4ml 38.7%蔗糖液,2ml 36%蔗糖液,2ml 37%蔗糖液,2ml,29%蔗糖液。在甩平转头中160000g,5℃离心1小时,用注射器收集含有高尔基膜的上部二个区带。
我们也可以用这个方法从全匀浆中来分离纯化高尔基膜,匀浆中蔗糖浓度配到43.7%,然后用以上不连续梯度来分离纯化,但是大于大容量匀浆,直接法是不合适的。
小结:以上典型实验(1)鼠肝匀浆为原料,以差分离心为主,辅以蔗糖的连续或不连续梯度分离各种亚细胞器,方法简单易行,或本也较低。我们也可以用Ficoll,percoll, Metrizamide,Nycodenz,……等等梯度材料来分离纯化亚细胞器。
参考文献:
(i)J. Graham "I solation of subcellular organelles and Membranes" IRL press. 1984
(ii)W.H.Evans "I solation and characterizationof membranes and cell organelles"Oxford University press.
(iii)G.J.Wagner Methods Enzymol, 148,55,1987
(iv)Rickwood. D等Anal, Biochem, 187,318,1990
(v)余兴明"离心技术"设备与方法1993
(VI)余兴明"亚细胞构造的离心分离"--概论,200