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标题:【求助】原核表达包涵体问题

rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是载体pET28a，我现在正在做复性这步，结果还没出来，想将这一系列做下去，检测包涵体纯化是否成功。我老板建议我降低温度，表达成可溶性蛋白。
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发表于 2013-4-24 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 rxcc33 于 2013-4-24 16:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用的是载体pET28a，我现在正在做复性这步，结果还没出来，想将这一系列做下去，检测包涵体纯化是否成功。我老板建议我降低温度，表达成可溶性蛋白。 ...


你做变性复性啊？复性不太好弄啊，我试过，稀释复性，复性效率很低很低，后来果断放弃了。我诱导温度已经降到10度了，诱导了36小时，包涵体确实少了，但是上清中的目的蛋白也少。祝好运。
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发表于 2013-4-24 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

pMAL-c2x是一个选择，可以试一试，其中的融合蛋白MBP有助溶作用，可以提高共表达目的蛋白的可溶性。但是得到的产物为“MBP-linker-目的蛋白”的一个融合蛋白，若要研究原始蛋白的酶学参数，还要特异性切下。
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发表于 2013-4-24 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你也遇到了和我一样的问题？怎么弄上清都少？

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难道理论上应该是上清比较多么？我做的基本也都在沉淀中
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好能上个page图，如果量可以的话，Ni柱纯化上清，就可以“富集”目的蛋白质了。不知道LZ在纠结什么？难道你的这个蛋白质非常容易失活？
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
pMAL-c2x是一个选择，可以试一试，其中的融合蛋白MBP有助溶作用，可以提高共表达目的蛋白的可溶性。但是得到的产物为“MBP-linker-目的蛋白”的一个融合蛋白，若要研究原始蛋白的酶学参数，还要特异性切下。

======================

嗯。我直接做真核表达去了
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最好能上个page图，如果量可以的话，Ni柱纯化上清，就可以“富集”目的蛋白质了。不知道LZ在纠结什么？难道你的这个蛋白质非常容易失活？

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我过了镍柱，梯度咪唑洗脱下来后跑胶，发现目的蛋白好少啊。以前做别的基因，诱导出来目的蛋白好大一坨啊···唉，直接真核表达去了。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
GST标签的不太好的话， 建议试试PcoldII和pcoldIV，PMAL的纯化成本太高
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位大侠，我用的是pGEX-6P-1，宿主是BL21，我的片段是492bp，我用了20度，25度，30度，37度，42度，目的条带大约在45KD，但对照在45KD处都有条带，ITPG浓度梯度也没看出有多大变化，请教各位大侠，该怎么样改进实验呢？
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