小中大有几个问题请教一下:
1 信号通路上的蛋白磷酸化位点是确定的吗?有些蛋白的磷酸化位点超过一个,都有相应的检测吗?
2 这个磷酸化程度的变化是用总蛋白来进行比较的吗?做WB的时候总是先做一个总蛋白的。
3 判断一个蛋白的磷酸化是否有变化,有一个绝对值的价值吗?就是象RT-PCR那样,的Ct值的变化要达到什么程度。
4 信号通路上有很多的蛋白,如何确定一个蛋白磷酸化变化后对通路的影响?还是通路上的每个成员都需要有变化才能够确定通路受到影响?
谢谢!
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非常专业的问题啊,这位老师一定对信号通路与磷酸化方面做过很多工作的!
以Full Moon公司的磷酸化水平检测芯片为例来回答您的问题:
1.芯片上的磷酸化位点都是文献报道过的;有些蛋白例如AKT确实是有多个磷酸化位点,芯片上对应着多个位点有多组特异性的抗体,也就是说通过芯片可以同时检测出一种蛋白的多个磷酸化修饰位点;
2.芯片上检测磷酸化水平,是通过同时检测该位点的磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白来实现的,针对1个磷酸化位点,芯片上包括一对抗体,分别特异性的识别其磷酸化修饰状态与非磷酸化修饰状态,获得一对信号,然后通过公式Phos Ratio = Phospho Signal / UnPhospho Signal 进行计算;
3.如2所回答的,Phos Ratio我们实际上可以理解为一个绝对值,是可以两个或者几个样本间进行比较的;
4.磷酸化变化与信号通路的关系我们是这样理解的,根据我们的经验以及发表的相关文献,一般判断一个信号通路是否发生改变,要看整个通路的调变情况,是否一个通路从上游到下游都发生了改变,用一个比喻来说,是不是大家都超一个方向跨出了一小步,这一小步则对应了细胞学或者行为上的一大步。