小中大有几个问题请教一下：
1 信号通路上的蛋白磷酸化位点是确定的吗？有些蛋白的磷酸化位点超过一个，都有相应的检测吗？
2 这个磷酸化程度的变化是用总蛋白来进行比较的吗？做WB的时候总是先做一个总蛋白的。
3 判断一个蛋白的磷酸化是否有变化，有一个绝对值的价值吗？就是象RT-PCR那样，的Ct值的变化要达到什么程度。
4 信号通路上有很多的蛋白，如何确定一个蛋白磷酸化变化后对通路的影响？还是通路上的每个成员都需要有变化才能够确定通路受到影响？
谢谢！
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非常专业的问题啊，这位老师一定对信号通路与磷酸化方面做过很多工作的！
以Full Moon公司的磷酸化水平检测芯片为例来回答您的问题：
1.芯片上的磷酸化位点都是文献报道过的；有些蛋白例如AKT确实是有多个磷酸化位点，芯片上对应着多个位点有多组特异性的抗体，也就是说通过芯片可以同时检测出一种蛋白的多个磷酸化修饰位点；
2.芯片上检测磷酸化水平，是通过同时检测该位点的磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白来实现的，针对1个磷酸化位点，芯片上包括一对抗体，分别特异性的识别其磷酸化修饰状态与非磷酸化修饰状态，获得一对信号，然后通过公式Phos Ratio ＝ Phospho Signal / UnPhospho Signal 进行计算；
3.如2所回答的，Phos Ratio我们实际上可以理解为一个绝对值，是可以两个或者几个样本间进行比较的；
4.磷酸化变化与信号通路的关系我们是这样理解的，根据我们的经验以及发表的相关文献，一般判断一个信号通路是否发生改变，要看整个通路的调变情况，是否一个通路从上游到下游都发生了改变，用一个比喻来说，是不是大家都超一个方向跨出了一小步，这一小步则对应了细胞学或者行为上的一大步。
