生物制药

版主和各位蛋白质技术的高手，我是一位蛋白质研究的新手，碰到了一个难题，想向各位请教，我的目标蛋白是19kD，是胞内表达的干扰素alpha-2b,以前的时候都是用ELISA进行活性检测的，只是用Lowry法测总蛋白，但是现在发现，一些变异的干扰素，包括氧化的产物等，竟然仍有活性，所以仅仅依靠ELISA法来监控含量已经不够，所以我想开发一个RP-HPLC的方法，想直接检测菌体中的干扰素含量，但是不知道那么杂的样品进样，分离度怎么样，所以想请教一下各位，我是想，先试一下，如果不行，再想别的办法，还有不知道超滤对样品的要求高不高？就是说菌体的提取物能不能直接用超滤来除去大部分的杂蛋白？而对我的目标蛋白的量不会造成损失呢。
还望各位大侠赐教。

============================================================================================================

我的理解是，您要寻找测定有活性的a-2b IFN的含量的方法？
目标蛋白是胞内表达的蛋白，很可能是包含体？
你的问题是：
1，是否可以用RP-HPLC定量？
2， 如果用，样品如何处理？
我的看法是：
A，如果您用RP-HPLC法，测定含量的方法属于化学方法，也就是通过面积积分，外标法或者内标法定量。但是对于有活性的蛋白，生物学测定才是唯一最信服的测定方法。当然，干扰素的生物活性测定方法很复杂。因为蛋白有比活性的问题，所以峰面积不能绝对说明问题。当然您把它作为比较方法之一也是可以考虑的。
B，如果用HPLC， 那么您的蛋白会因为氧化或者其他结构的变化会导致极性的差异，在进行分离时候会与目标峰分开，您首先需要定性确认峰 的归属，然后再定量。在用RP-HPLC时候，因为使用有机溶剂做流动相，对于脆弱的蛋白说来，环境比较恶劣，所以小心操作为妙！避免蛋白迅速变性堵塞柱子。而且样品需要好好处理。有机溶剂的浓度慎重选择，不能太高，梯度的化，不能太快！
C，样品处理：如果是包含体，则需要溶解后切向流去除小分子溶解剂兼浓缩，建议选择3K或者5K膜包更换缓冲液。然后用大分子膜包除去大分子杂蛋白，建议用100K膜包。
如果不是包含体，则溶解复性的步骤就省了。
D， 建议稍微进行处理，比如过滤去除杂质，再超滤，以保护膜包的寿命。

我想解释一下，我的蛋白因为非大肠杆菌表达，无包涵体，所以相对来说处理简单一点，只是里面的杂蛋白可能比较多。而且欧洲药典对干扰素相关蛋白检测是用的RP-HPLC法（可以将干扰素降解产物与干扰素主峰有效分离），而且纯度检测也是用RP-HPLC与SDA-PAGE共同来说明，所以这个方法对干扰素纯品的正确三维结构是可以专一的定性的，我现在就是想用同样的方法来进行纯化中控和菌体质量检测，所以样品处理最好是能够简单方便，并且去除杂蛋白效果又比较好的一种方法。
另外，我说的ELISA作为免疫活性检测，是因为细胞培养法（生物活性检测）不但误差大，而且周期长，所以仅用ELISA法，但现在发现ELISA法不能有效监控菌体和中控产品的质量。
所以RP-HPLC法应该是检测正确三维结构的干扰素和其降解产物量的最有前途的方法，因为现有的活性测定方法无法做到这一点。
但只是样品处理可能比较难。
我现在只能边试边看了，因为还没有想到一个我上边提到的那么一个好办法

==============================================================================================================

基本理解您的目的。
同意您的方法。但是操作要十分小心！流动相的有机溶剂浓度要十分注意！在做蛋白的时候，不小心，很容易毁坏柱子。
有一点我觉得您的提法有待商榷。RP-HPLC检测蛋白的三维结构？我觉得该说法不合适。即便失活性的蛋白，和没有失去活性的蛋白，您用RP-HPLC是很难分开的。而蛋白质的三维结构更是不可能检测的。只能说确认三维结构的构象，那也不是HPLC所能够的。HPLC的最大特点和功能就是分离！

还有一个有关超滤的问题要请教各位：我买了安捷伦的300A的柱子要做上边的分析定量，昨天安捷伦的产品工程师告诉我说，对于比较杂的样品，分子量大于100KD就可能堵塞300A的柱子，就是说对于分子量小于100KD的蛋白质通过改变流动相梯度都能得到有效分离。所以我考虑将我的样品粗提物通过超滤去除其中的大分子蛋白质，我的目标蛋白是19KD，想请问各位大侠我该选择多大孔径的超滤膜，可以将其中的大分子蛋白尽可能去除，而对我的目标蛋白没有什么损失？如果选用Millipore的超滤膜的话。

=============================================================================================================

我只能告诉您：如果用PALL的膜，100K是可以的，19K应该有比较好的回收，甚至达到99，9%，或者几乎100%，而大分子蛋白透过的可能性很小。
至于Millipore的膜包，我没有发言权。不过，有一点可以肯定，两者材料不一样，分子截留大小不一样，透过效率不一样，至于它是多少，抱歉，我不能胡言乱语。
还有，我觉得堵塞柱子更可怕的是RP-HPLC用到的有机溶剂，这个要比蛋白本身对柱子的影响好的多。而且本来TFF之后的样品，大蛋白含量是非常低的，基本没有。

我觉得最简单的方法就是用预柱，100kDa以下的蛋白也不一定不沉淀在柱里。

==============================================================================================================

预柱也要小心。蛋白是娇嫩的，脆弱的，也是神奇的！很重要的一点是寻找合适的流动相浓度。个人觉得要是用剃度的话，变化一定要缓慢，连续剃度优于不连续剃度，否则柱子容易受伤。