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标题:【求助】蛋白浓缩方法

yes4[使用道具]
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我想用冷冻干燥法浓缩细胞上清,但听说并不是直接将高稀释的上清进行干燥,而先将上清浓缩一下比如用超滤离心,在进行干燥为好,是这样吗?另外,上清吸出后放在-70保存,日后在浓缩,蛋白应该不会降解把?
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二丫头466[使用道具]
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冷冻干燥的体积当然越小越好了,如果你的蛋白很稳定那-70度应该没有什么问题的,我觉得冷冻干燥时间长,如果量不大直接用沉淀的方法浓缩就可以了。浓缩的目的是使体积小这样快,而体积很大的话冷冻干燥慢,如果你的冷冻干燥机的真空、泵很好,那么体积大也没有关系,但是要保证你的液体的高度别超过2cm那其实也是很快的,所以关键看你样品的体积和你机器的好坏了。
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flower-201[使用道具]
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我的问题有点奇怪,我的蛋白17KD,可溶性的,纯化的也非常好,就是用Millipore的超滤管,一超滤,就会出来很多沉淀,SDS-PAGE鉴定这些沉淀全是我的目的蛋白!!很心疼。请教各位老师,为什么我的蛋白一超滤会形成沉淀呢,万分感谢!十分着急
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我的问题有点奇怪,我的蛋白17KD,可溶性的,纯化的也非常好,就是用Millipore的超滤管,一超滤,就会出来很多沉淀,SDS-PAGE鉴定这些沉淀全是我的目的蛋白!!很心疼。请教各位老师,为什么我的蛋白一超滤会形成沉淀呢,万分感谢!十分着急

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从现象来看,你的蛋白应该是疏水性比较强的,在超滤之前,由于蛋白浓度低,蛋白分子之间的相互作用还不足以影响到分子的聚集,所以是澄清的;但当超滤浓缩后,随着蛋白质浓度的增高,蛋白质分子相互碰撞的几率增加,这时由于疏水作用而相互聚集,最后形成沉淀。可以采取降低缓冲体系的极性的方法或添加一些表面活性剂甚至有机溶剂来提高溶液的非极性来加以解决。不过最终还是要通过试验来验证哪种方式合适。
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xue258[使用道具]
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如果你的上清液体积很小,例如只有100-200ml那么可以用amicon ultra-15,这种浓缩管一次上样15ml,多做几次就可以了,如果体积很大,例如1L-2L,建议你用viva flow,这种浓缩装置很不错的,而且效果也很不错,可以选择不同截留分子量的膜。最近一直在用觉得很不错向你推荐。
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hustwb[使用道具]
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(一)透析袋浓缩法
利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替),结扎,把高分子(6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30%-40%浓度的溶液,将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后,可放入温箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。
(二)冷冻干燥浓缩法
这是浓缩蛋白质的一种较好的办法,它既使蛋白质不易变性,又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻,然后移置干燥器内(干燥器内装有干燥剂,如NaOH、CaCl2和硅胶等)。密闭,迅速抽空,并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便,应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。
(三)吹干浓缩法
将蛋白溶液装入透析袋内,放在电风扇下吹。此法简单,但速度慢,且温度不能过高,最好不要超过15℃。
(四)超滤膜浓缩法
此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出,而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩:一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内,在不断搅拌之下过滤;另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上,负压抽气,而使袋内液体渗出。
(五)凝胶浓缩法
选用孔径较小的凝胶,如SephadexG25或G50,将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内,凝胶粒子吸水后,通过离心除去。
(六)浓缩胶浓缩法
浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物,具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml~150ml。它能吸收低分子量的物质,如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等,适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后,蛋白质的回收率可达80%~90%。比浓缩胶应用方便,直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意,浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点,否则在浓缩胶表面产生阳离子交换,影响浓缩物质的回收率。

这些都是常用的蛋白浓缩方法,你可以系统参考学习下,但要适用到你的实验要求里,不仅要浓缩蛋白还要除去小分子蛋白,但我不知道你所说的小分子蛋白是多大分子量的?小于20KD的可以选择0.45um的透析袋除去,挺便宜也很好用,但稍微大点的话,恐怕就不行了,这时恐怕用商品化的超滤管才是有效的方法,虽然贵点,但效果比较好,但它还要求离心机的转速能够达到150000RPM以上为好,祝顺利
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birdfish[使用道具]
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我用的是硫酸铵沉淀法,物廉价美。
用4度饱和硫酸铵等体积加入收集的上清中, 以30000g的速度离心30分钟,弃上清,加入你所需体积的缓冲液体,在震荡器上使沉淀溶解,再在10000g下离心10分钟取上清分装保存于-80度即可

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请问,跑sdspage的话,硫酸铵需要除去么?我的样品体积很小,再除硫酸铵的话怕剩不下多少了。能否将沉淀直接加入样品缓冲液-沸水浴5分钟-电泳?
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二丫头466[使用道具]
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刚才看了一下大家的讨论也想参与一下,想请教大家一个问题,
我现在在做毛细管电泳分离DNA,用的是UV检测器,
买的DNA Marker的浓度每个条带大约10ng/ul ,这么的浓度紫外检测不到,
至少需要每个条带含200ng/ul,各位大虾,谁知道哪里可以买到吗 ?
或则通过什么方法才能得到高浓度的DNA,我用过乙醇浓缩的方法,
但是还是不理想,哪里可以订制高浓度DNA吗?
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sunnyB[使用道具]
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我做wb需要的是蛋白煮沸变性5分钟,我想能否多煮沸几分钟让水分蒸发掉不就可以把蛋白浓缩了么?我的问题比较幼稚,刚开始做wb,提的蛋白浓度比较低,不知道可行不?谢谢指教!
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koook5695[使用道具]
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很高兴有这么多高人,我想问一个浅浅的问题,在用透析袋浓缩时,聚乙二醇 的分子量从1200-20000的都有,到底是根据什么来选择呢?是透析袋还是什么因素?请各位战友帮忙解除这个疑惑!谢谢啦!
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