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标题:【求助】WB实验，大分子量蛋白的内参、MARKER、...

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发表于 2013-4-27 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用分离胶3%~10%梯度胶，浓缩胶3%
内参你可以随便选哪一种
另外我还可以帮你把图片的数据都处理了
有兴趣可以和我联系（**）
做的是肌肉组织的吗？
你在北京吗？
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发表于 2013-4-27 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

10天抗体能到的话应该就可以搞定了
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发表于 2013-4-27 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Marker就只有那么大了
你有多少样？
需要做多少张膜？
每张膜8个样
我可以接你的活
你只需要提供你的目的蛋白的抗体
内参与二抗我可以提供（不过内参的一抗要单独收取费用）
我就是用梯度胶做的
另外你要告诉我具体蛋白名称

==============================================================================================================

我看到有公司有卖600多KD的MARKER，不知兄台觉得有没有必要？普通MARKER能否说明问题？因为我看几篇做大蛋白的大牌杂志文章都是只选用最大200多的。
我有16个样，两张膜能够了吧？不过还得做MARKER，实在不行就少做一个样。
我在广州，现在只是预试验，接下去还要做不少WB。
我做的是肿瘤细胞，做的蛋白为MACF1。
一抗这两天马上到了，所以这几天还得请兄台多多指导哈！可惜不在同城无法当面感谢啊！还请版主多多加分！改天兄台过来广州可别忘了说一声。
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发表于 2013-4-27 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GE有一种Native-PAGE 的高分子量Marker
最大有600K
不适合SDS-PAGE
不过可以先确认一下条带的大概位置
祝你好运
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发表于 2013-4-27 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好用梯度胶
可以保留内参
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发表于 2013-4-27 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗今晚到了，还算顺利，就看接下来的实验了。
附上一张cell文章的WB图，作者用的便是200多的marker，文章没给出，但我考虑可能是用了梯度胶。ACF7即我要检测的大蛋白。


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附件
2013-4-27 15:52
24214739.jpg (22.25 KB)
 
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发表于 2013-4-27 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

明天开始准备试剂，跟着师姐先看一遍，后天正式开工。内参使用实验室有的GAPDH，marker使用200多KD的试试先，梯度胶配制采用方兄的独家秘方，转膜条件参考方兄方法。
janlont战友说的一抗问题不用太过考虑，但我这个一抗比较特殊，有几点让我信心不是很足。它为santa公司的兔多抗，其他santa一抗说明书均会附WB图，但该抗体不知为何没有，此为其一；其二，该商业一抗目前仍未有文章使用过，总共10篇左右文章全部自己制备，我实在没这个精力时间去自行配制，毕竟只是预试验，不一定能出结果。而全世界只有这个蛋白一抗能满足我的实验条件，只能选它。所以我所担心的更多的是其非特异性而不是特异性，多抗毕竟特异性会高些，但非特异性就不好说了啊，弄不好出来N条带，到时可能影响实验结果判读。此外，也不知这个蛋白的表达情况，说不定条带太浅都可能，这个估计要自己摸一抗的浓度了。

谢谢方兄和其他战友的指点！我将随时反馈我的实验过程和结果！
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发表于 2013-4-27 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这么大的蛋白我也没做过，一抗为santa公司的兔多抗，santa公司的抗体出厂不做检验，质量如何还不好确定，而且还是多抗，估计会遇到一些困难。

建议：看到附上一张cell文章的WB图，作者用的便是200多的marker，
你也可照此办理，200多的marker，梯度胶

fangweibin119战友做过大蛋白，可参考他的实验条件。

蛋白先跑个PAGE，梯度胶，顺带200多的marker，看下大致位置有无条带

cell文章的WB条件可以重点参考，目的蛋白和你的一样，抗体你看下在哪买的，也可问下购买。
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birdfish[使用道具]
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 小中大

梯度胶在转膜的时候要小心
3%的很软
自己多试试吧
把邮箱发给我
我把我们做的资料发给你
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发表于 2013-4-27 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在做大蛋白的WB，分子量约280KD，想用梯度胶来跑，一直未找到好的配方和条件，能否将你的资料发给我学习一下呢？
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