蛋白质与蛋白组学

6. Broad-Range Buffers
There may be occasions where a single buffer system is desired that can span a wide pH range of perhaps 5 or more pH units. One method would be a mixture of buffers that sufficiently covers the pH range of interest. This may lead to nonspecific buffer interactions for which corrections must be made. Another common approach is to use a series of structurally related buffers that have evenly spaced pK values such that each pK is separated by approximately _1 pH unit (the limit of buffering capacity). The Good buffers are ideal for this approach since they are structurally related and have relatively evenly spaced pK values. As the pH passes the pK of one buffer it becomes nonparticipatory and therefore has no further function. These nonparticipating buffer components may show nonspecific buffer effects as well as raising the ionic strength with potential deleterious effects. A detailed description of buffer mixtures which provide a wide range of buffering capacity with constant ionic strength is available (Ellis and Morrison, this series).

有时候要求一种缓冲体系可以跨越5个或更大的pH单位范围。方法之一是应用能够覆盖要求pH范围的混合缓冲液。这也可能导致非特异性的缓冲液相互作用，必须做校正。另一个常用方法是使用一系列结构上相关的缓冲液，它们具有均匀的pK间隔，例如每个pK大约相差1个pH单位。当pH跨越一种缓冲液的pK时，这种缓冲液就不在参与缓冲作用，也就没有了进一步的功能。这些不参与性的缓冲液组分也不会表现出非特异性的缓冲液作用，诸如升高离子强度之类的潜在负面影响。具有恒定离子强度、宽广缓冲容量的混合缓冲液已有文献进行过详细描述（本书系列中Ellis and Morrison的大作）。

7. Recipes for Buffer Stock Solutions
缓冲液储存液配方
（略）

配方很多书的附录中都有，例如生物化学实验，分子克隆等等。但我还是有几点要说的：

1、各种书中的配方往往有些小的差异，要通过自己的实际配制后来进行选取。这到不是说那种书是对的，那种是错误的。这可能是每种书这个配方表的最初来源不同，当初做这个表的人所使用的试剂或水等等与其他的人有差别。

2、不管使用那种配方表，溶液在配制好以后都要进行pH计的检测校正。因为在我们的试验室中，水或试剂的批号的不同可能会有差别。

3、在我的印象中，PB磷酸盐、CB碳酸盐缓冲液按配方配制后其pH往往很准确，Tris缓冲液是用HCl调节配制的，没什么问题，而柠檬酸盐和甘氨酸缓冲液往往pH差距较大。

相关疾病：
感冒

酶活性检测
（略）

本书我主要是对蛋白质纯化感兴趣，对酶的检测方法不感冒，所以本章略过。

有价值的一个图表。

2. General Instructions for Reagent Preparation
For the methods detailed, reagents should be used at the highest purity available and dyes should be obtained at spectroscopy grade where available. Ideally deionized, filtered water should be used at a minimum quality of 18 MΩ cm and a total organic carbon of below 6 ppb. All buffer preparations should be filtered using 0.2 μm filtration (Millipore, Sartorius) devices upon preparation to remove bacteria and fines. If precipitation occurs during storage, the reagent should be discarded, unless stated in the method.
（略）

要求好高！最高纯度的试剂、光谱级的染料、18 MΩ cm的无菌过滤纯水，做药厂的QC可能应该满足这些条件，我等试验室的纯化恐怕没这个条件，也觉得没有这么恐怖。
顺便说一下，18 MΩ cm是电阻率的单位，表征离子强度吧。

3. Ultraviolet Absorption Spectroscopy
3.1. Ultraviolet absorbance at 280 nm (Range: 20–3000 ug)
紫外吸收光谱法
紫外吸收280nm（范围：20-3000ug）

这个范围很不地道。定量定的是浓度，又不是质量。用质量单位来表述毫无参考意义！

Proteins display a characteristic ultraviolet (UV) absorption spectrum around 280 nm predominately from the aromatic amino acids tyrosine and tryptophan. If the primary sequence contains no or few of these amino acids，then this method will give erroneous results. Quartz crystal cuvettes are routinely used for measurement as plastic materials can leach plasticizers, and are not UV transparent. Similarly, buffer components with strong UV absorbance such as some detergents especially Triton X-100 should be avoided (Table 8.1) and ‘‘blank’’ samples should be measured using the sample buffer solution but with no protein present. UV absorbance is routinely used to give an estimate of protein concentration but if the molar extinction coefficient of the protein is known then the Beer–Lambert law can be used to accurately quantitate amount of protein by UV absorbance, assuming the protein is pure and contains no UV absorbing nonprotein components such as bound nucleotide cofactors, heme, or iron–sulfur centers.

在280nm附近蛋白质所表现出来的紫外吸收特性主要是由芳香性氨基酸，色氨酸和酪氨酸，所贡献。如果一级序列中没有或含很少此类氨基酸，本方法将得到错误的结果。通常用石英杯来进行测定，而塑料制品会释放塑化剂之类的物质，有紫外吸收不可用。同理，缓冲液组分中含有强紫外吸收物质的，如一些表面活性剂，特别是Triton X-100，应该避免使用。空白校正样应该用不含待测蛋白的样品缓冲液制备。紫外吸收值通常用来估计蛋白浓度，但是如果满足下列几个条件，就可以用Beer–Lambert定律准确定量蛋白浓度：样品蛋白的摩尔消光系数已知；纯蛋白；不含结合核苷酸辅基、亚铁血红素或铁-硫中心等有紫外吸收的非蛋白组分。

在此先更正自己的一个错误认识。在（一）中我以为280nm吸收的氨基酸还包括苯丙氨酸（Phe），在本节中看到还没有Phe，不禁去仔细地查看了一下《生物化学》教材。应该说本节的描述没有错。准确地说，近紫外区（220-300nm）吸收的氨基酸有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，但苯丙氨酸的最大吸收波长为257nm，而且其摩尔消光系数较小，对280nm紫外吸收的贡献小，可以忽略。

1、苯丙氨酸最大吸收波长257nm，此处的摩尔消光系数为200；
2、酪氨酸最大吸收波长275nm，此处的摩尔消光系数为1400；
3、色氨酸最大吸收波长280nm，此处的摩尔消光系数为5600；

用狗搜了一张图片如下：

Beer–Lambert (molar absorption coefficient):

where am is the molar extinction coefficient, c the concentration of analyte, and l the path length in cm.
（略）

在这里可以看到光吸收值与浓度和光径有关，成线性关系。

3.2. Method
For the measurement of a protein with unknown extinction coefficient, using a protein standard:
1. Add blank buffer to a clean quartz cuvette and use to zero the spectrophotometer.
2. Either using a fresh identical cuvette or replace the buffer with the sample, then measure the absorbance at 280 nm. If the signal is outside the linear range of the instrument (typically an absorbance greater than 2.0), then dilute the protein in buffer and remeasure.
3. After measurement of the sample remeasure the blank buffer to correct for any instrument drift.
4. Determine the unknown concentrations from the linear standard response.

方法
测定未知消光系数的样品蛋白，要用标准蛋白做对比：
1、加空白用缓冲液到干净的石英比色皿，仪器调零。
2、使用干净的同种比色皿装样品蛋白液，或不换比色皿，用样品蛋白液替代调零用空白缓冲液，测定280nm吸收。若读值超出仪器的线性范围（通常吸收值大于2.0），用缓冲液稀释样品蛋白，重新测定。
3、样品测定后，再检测一次空白缓冲液，以校正仪器的漂移。
4、由线性标准曲线得到未知的样品浓度。

1、对文章中的线性范围有看法。文中给出的值为2.0，这个值太大了些。一般对于光度分析法来说，超过1.0的值就很难保持良好的线性了。
另外，文中没有提到下限，这也是不严谨的。
我们在实际工作中一般控制吸光度的值在0.2-0.8之间，最好是0.4-0.7之间，即：
A280=0.4-0.7
相应的蛋白浓度粗略的估计为C=0.3-0.5mg/ml。
不在此范围的吸光度，就进行稀释调整。

2、比色皿个人以为还是用同一个的好。因为比色皿使用时间稍长，可能就有一些看不见的细微划痕，对读数有影响。

3、仪器的漂移常见。但如果仪器经过了充分的开机预热，一般在15min以上吧，漂移问题不大。

4、样品的吸光度值要在标准曲线的上下限范围内。

3.3. Comments
The determination of the absorbance coefficient for a protein is discussed below but if a stock of the protein at known concentration is available then this can be used as a standard. Very rough estimates can be made from the relationship that if the cuvette has a path length of 1 cm, and the sample volume is 1 ml then concentration (mg/ml)=absorbance of protein at 280 nm.
（略）

此小段有两处值得商榷的地方。

if the cuvette has a path length of 1 cm, and the sample volume is 1 ml then concentration (mg/ml)=absorbance of protein at 280 nm

1、值应该与比色皿的光径有关，但与样品体积无关，可见Beer–Lambert公式。

2、浓度估算，1mg/ml=1A280，确实可能造成很大误差。对大肠杆菌破菌上清这么估算的话，浓度可不是一般的高。要说明一下要求，例如溶液体系除蛋白外，其它杂质含量较少等。