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标题:【讨论帖】Blue-Native PAGE(BN-PAGE)技术讨论

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-2 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 gogo 于 2013-5-2 11:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想请问一下, BN-PAGE实验需要特殊的仪器吗? 普通的western blot电泳设备能否用呢?

不要很特殊的仪器，只要一个能灌梯度胶的梯度混合仪和一个恒流泵就可以了。
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-5-2 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
通过实验发现新的蛋复合物，这个我想在线粒体和类囊体里面的可能性不大，至于质膜或者细胞质中的蛋白质复合物倒是有这种可能。我想要发现一个新的蛋白复合物存在的话还是要废不少精力的，要通过bn的方法发现可能首先实验的技术就很重要，michael11兄也做了一些，要把bn本身做好，一般也就是那些别人已经发现了的，要发现新的，可能在样品的制备上要下点功夫。至于在bn上发现了新的复合物再验证的话，这个方面我还没有做过，只是一些文献的参考，做一些蛋白质蛋白质相互作用来排除假阳性，或者是co-ip，或者是细胞学的定位看是不是有复合物的可能，总之工作量应该是比较大的。
我想通过bn的方法直接发现新的复合物可能比较困难，但是通过这种方法发现一些已有复合物的未知亚基（特别是一些小分子量的），还是有可能的，这些未知的亚基也还是很值得做的。
至于上样前确定复合物的存在，这个可能没有什么更好的方法，测酶活也只是确定一个已经研究的比较透的复合物存在，还是通过bn拿到结果就知道复合物是不是存在了。

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我也在做BN-PAGE 您说很难找到新的复合物，不知道为什么啊
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-5-2 11:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
梯度混合仪和恒流泵我们都没有，想用pre-cast gels，但规格难定；
有人说电泳仪不需要特殊的，有人说小型的不行……我们有17cm和8cm的两种电泳槽，选哪种更好（目前准备订pre-cast gels）？

谢谢！
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2013-5-2 11:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
近一个月以来一直在做线粒体的bn-page ,但是感觉很难的，尤其是样品的制备方面，去垢剂和蛋白质的比例方面的，不知baiy大哥有没有好的办法。还有好的文章吗，发给我
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-2 11:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 moonlight45 于 2013-5-2 11:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
梯度混合仪和恒流泵我们都没有，想用pre-cast gels，但规格难定；
有人说电泳仪不需要特殊的，有人说小型的不行……我们有17cm和8cm的两种电泳槽，选哪种更好（目前准备订pre-cast gels）？

谢谢！ ...

我还是建议你自己买梯度混合仪和恒流泵做，那个也不是很贵，而且这个好像没有pre-cast gels，这个和一般的sds还是有点区别的。至于胶的大小，我看不能太小也不能太大，大约10左右比较好。而且最好是那种国产的简易槽，又省电极buffer，效果也好。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-2 11:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yjf1026 于 2013-5-2 11:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
通过实验发现新的蛋复合物，这个我想在线粒体和类囊体里面的可能性不大，至于质膜或者细胞质中的蛋白质复合物倒是有这种可能。我想要发现一个新的蛋白复合物存在的话还是要废不少精力的，要通过bn的方法发现可能首先实验的 ...

我是说想在别人已经做过的样品里面发现新的复合物比较困难，比如线粒体和类囊体。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-2 11:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 zhezhe 于 2013-5-2 11:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
近一个月以来一直在做线粒体的bn-page ,但是感觉很难的，尤其是样品的制备方面，去垢剂和蛋白质的比例方面的，不知baiy大哥有没有好的办法。还有好的文章吗，发给我 ...

线粒体我的感觉是样品很重要，就是拿到比较纯的线粒体比较重要，另外一个方面是拿到线粒体以后的样品处理，percoll一定要去干净，这个很影响结果。至于去垢剂和蛋白质的比例方面，这个只能是你自己的样品自己做剃度，摸索好的条件了。现在我在北京，文章什么的等回去发给你，其实应该一般的文章都有吧。
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发表于 2013-5-2 11:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教各位,这个方法是不是针对膜蛋白的?拿来做全蛋白的话,是不是不容易分清楚?
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-2 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 8s5g 于 2013-5-2 11:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教各位,这个方法是不是针对膜蛋白的?拿来做全蛋白的话,是不是不容易分清楚?



bn是用来分析蛋白质复合物及亚基的，全蛋白不是很好做。
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H2O[使用道具]
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发表于 2013-5-2 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真的没想到有这么多战友做bn,我也做过一阶段类囊体膜的,楼上有位所贴的protocol里的图就是我老板跑的.一直还井底之蛙的以为bn只是做叶绿体和线立体膜的
最近做松树的bn遇到点问题还想请教楼主: 最后用增溶剂增溶时总是溶不下来,跑出的条带还很淡,同样的方法做拟南芥和其他植物都没有问题.这是提取的问题还是其他的问题，望赐教!
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