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标题:【讨论帖】Blue-Native PAGE(BN-PAGE)技术讨论

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2013-5-2 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下，在做线粒体的bn-page 时，纯化线粒体用什么梯度比较好，纯化后的线粒体还得破碎线粒体膜吗？
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-2 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真的没想到有这么多战友做bn,我也做过一阶段类囊体膜的,楼上有位所贴的protocol里的图就是我老板跑的.一直还井底之蛙的以为bn只是做叶绿体和线立体膜的
最近做松树的bn遇到点问题还想请教baiy老兄: 最后用增溶剂增溶时总是溶不下来,跑出的条带还很淡,同样的方法做拟南芥和其他植物都没有问题.这是提取的问题还是其他的问题，望赐教!

===============================================================================================================

这个可能和样品本身有关吧,不知道你做的是不是类囊体,如果是,我想可能是样品里面有些树特有的成份,那样的话最好是找树的叶绿体的提取方法.还有就是溶不下来的你再用sds跑跑看里面蛋白怎么样.
张立新老师实验室的,和我们老板是朋友啊,不知道是植物所还是兰大的,多多交流.
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发表于 2013-5-2 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 shenkunjie 于 2013-5-2 12:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想问一下，在做线粒体的bn-page 时，纯化线粒体用什么梯度比较好，纯化后的线粒体还得破碎线粒体膜吗？

用percoll比较好一点,后面的问题protocol里面有,一定要提到好的样品才能做好.
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发表于 2013-5-2 12:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
植物percoll梯度离心剂怎么配制，还需要哪些特制的配制溶液马？
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 小中大

在做BN胶时用的bistris和SDS胶用的tris有什么区别？为什么有些抗体在BN胶上不好用啊？是什么原因吗？
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 小中大

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 小中大
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发表于 2013-5-2 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在做BN胶时用的bistris和SDS胶用的tris有什么区别？为什么有些抗体在BN胶上不好用啊？是什么原因吗？

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从结构式看起来bistris应该比tris的缓冲能力更强,这样更有利于保护复合物的完整性，这是我的理解。我也没有用tris做过bn，不知道效果怎么样。至于你说有些抗体在bn上不好用，不知道你做的什么样品，是不是在sds的时候能有好的结果，而在bn的时候出问题。这个可能是你的蛋白经过bn后量太少了。在抗体的识别上应该没有问题，大家都是经过sds变性的，蛋白都是伸展的结构。
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发表于 2013-5-2 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢！有些抗体不好用是你上传的做BN经典PROTOCOL中说的，还举了几个例子。“Some antibodies do not work in BN-PAGE, i.e. anti-BAP31 and anti-BAP29 antisera”。另外，蛋白应该是没有SDS变性吧，否则复合物将应该会完全打开。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-2 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

bn后要经过第二向的sds啊,第二向就是一个变性的过程,中间也要经过一步平衡,平衡液里面就有sds,所以那里面说"Some antibodies do not work in BN-PAGE, i.e. anti-BAP31 and anti-BAP29 antisera, therefore, a second dimension has to be used in these cases."bn里面做不出western,我想应该就是结构的问题,复合物的存在使一些识别位点包裹在复合物的里面,所以出不了结果,这是单纯只做第一向bn的结果,经过第二向sds就不会有问题了.
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