【讨论帖】蛋白质结构解析 - 经验共享

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】蛋白质结构解析

121 2/13 ‹‹1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ›››|

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】蛋白质结构解析

koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态离线

发表于 2013-5-2 13:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

更加形象一点

附件

2013-5-2 13:38

37674285.snap.jpg (26.77 KB)

8princess8[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75310
精华 1
积分 664
帖子 821
信誉分 103
可用分 5056
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态离线

发表于 2013-5-2 13:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这里转贴一些搜索到的关于 synchrotron 的内容，同步加速器是做蛋白质晶体 X-ray 衍射必不可少的大型设施。

同步加速器是一種環形的粒子加速器，使用磁場（讓帶電粒子在運行中可以改變方向）及電場（加速帶電粒子）與運行中的帶電粒子束同步化操作。粒子迴旋加速器使用均勻的磁場及固定頻率變化的電場加速帶電粒子，如果改變其中一項則為同步粒子迴旋加速器，兩者都改變則為同步加速器。藉著改變參數使帶電粒子獲得能量，同步加速器中的粒子束具有固定軌道，在抽真空的環境中（儲存環）不斷的運行。同步加速器中的儲存環包含了直線段與彎曲的部分，前後相連在一起。因此在結構上和粒子迴旋加速器有很大的不同。而儲存環中彎曲的部分會有許多磁鐵設施使粒子束改變運行方向；直線段的部分則設置高頻共振腔使用高能量的微波提供粒子加速所需的電場。

粒子在粒子迴旋加速器中，從中心以螺旋軌道運行到腔壁時，粒子迴旋加速器的最大半徑限制了粒子最後所獲得的全部能量。另一方面若以增加磁場強度的方式來提高加速能量，也有其極限。所以有同步加速器的出現。

同步加速器可以克服粒子迴旋加速器所遇到的問題，可以使用一個較小的管子來傳送粒子束，管子旁可裝設許多聚焦用的磁鐵或其他設施。

Armenia
Center for the Advancement of Natural Discoveries using Light Emission (CANDLE), Yerevan (proposed) [1]

[edit] Australia
Australian Synchrotron (AS), Melbourne, Victoria, [2] (under construction)

[edit] Brazil
Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), Campinas

[edit] Canada
Canadian Light Source (CLS), University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan

[edit] China (PRC)
Beijing Synchrotron Radiation Facility (BSRF), Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing
National Synchrotron Radiation Laboratory (NSRL), University of Science and Technology China, Hefei
Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF), Shanghai (under construction)

[edit] Denmark
Institute for Storage Ring Facilities (ISA, ASTRID), University of Aarhus, Aarhus, [3]

[edit] France
European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble
Laboratoire pour l'Utilisation du Rayonnement Electromagnétique (LURE), Orsay (decommissioned)
Soleil, Saint-Aubin

[edit] Germany
ANKA, Forschungszentrum Karlsruhe, Karlsruhe, [4]
Berliner Elektronenspeicherring-Gesellschaft für Synchrotronstrahlung (BESSY), Berlin, [5]
Dortmund Electron Test Accelerator (DELTA), Dortmund University, Dortmund, [6]
ELBE, Forschungszentrum Rossendorf, Dresden, [7]
Electron Stretcher Accelerator (ELSA), University of Bonn, Bonn, [8]
Hamburger Synchrotronstrahlungslabor (HASYLA, at DESY, Hamburg, [9]

[edit] India
INDUS, Center for Advanced Technology, Indore

8princess8[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75310
精华 1
积分 664
帖子 821
信誉分 103
可用分 5056
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态离线

发表于 2013-5-2 13:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[edit] Italy
DAFNE Light, Laboratori Nazionali di Frascati (LNF), Frascati, [10]
ELETTRA Synchtrotron Light Source, Trieste, [11]

[edit] Japan
Hiroshima Synchrotron Radiation Center (HSRC), Hiroshima University, Hiroshima
Instute of Free Electron Laser (iFEL), Osaka University, Osaka
IR FEL Research Center (FEL-SUT), Tokyo University of Science, Tokyo, [12]
Medical Synchrotron Radiation Facility, National Institute of Radiological Sciences, Chiba
Nagoya University Small Synchrotron Radiation Facility (NSSR), Nagoya University, Chikusa-ku, Nagoya, [13]
Photon Factory (PF) at KEK, Tsukuba
Photonics Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba Science City, Ibaraki
Saga Light Source (SAGA-LS), Tosu, Saga, [14]
Super Photon Ring - 8 GeV (SPring-8), Nishi-Harima
Ultraviolet Synchrotron Orbital Radiation Facility (UVSOR), Okazaki, [15]
VSX Light Source, University of Tokyo, Kashiwa, [16]

[edit] Jordan
Synchrotron-light for Experimental Science and Applications in the Middle East (SESAME), Al-Balqa Applied University, Salt, [17]

[edit] Netherlands
Free Electron Laser for Infrared eXperiments (FELIX), FOM-Institute for Plasma Physics, Nieuwegein

[edit] Russia
Dubna Electron Synchrotron (DELSY), Joint Institute for Nuclear Research (JINR), Dubna near Moscow, [18]
Kurchatov Synchrotron Radiation Source (SIBIR-1, SIBIR-2), Kurchatov Institute, Moscow, [19]
Siberian Synchrotron Radiation Centre (SSRC), Budker Institute of Nuclear Physics, Novosibirsk, [20]
U70 synchrotron Institute for High Energy Physics, Protvino near Moscow, [21]
TNK F.V Lukin Institute, Zelenograd near Moscow, [22]

[edit] Singapore
Singapore Synchrotron Light Source (SSLS), National University of Singapore, [23]

[edit] South Korea
Pohang Accelerator Laboratory, Pohang University of Science and Technology, Pohang, [24]

[edit] Spain
ALBA, Barcelona, [25]

[edit] Sweden
MAX-lab, Lund University, Lund, [26]

[edit] Switzerland
Swiss Light Source (SLS), Villigen, [27]

[edit] Taiwan
National Synchrotron Radiation Research Center (NSRRC), Hsinchu, [28]

[edit] Thailand
National Synchrotron Research Center (NSRC), Nakhon Ratchasima, [29]

[edit] United Kingdom
Diamond Light Source, Didcot
Synchrotron Radiation Source (SRS), Daresbury, [30]

[edit] United States
Advanced Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, California
Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory, Argonne, Illinois
Center for Advanced Microstructures and Devices (CAMD), Louisiana State University, Baton Rouge, Louisiana
Cornell High Energy Synchrotron Source (CHESS), Cornell University, Ithaca, New York
UCSB Center for Terahertz Science and Technology (CTST), University of California, Santa Barbara, Santa Barbara, California, [31]
Duke Free Electron Laser Laboratory (DFELL), Duke University, Durham, North Carolina
Jefferson Laboratory Free Electron Laser (Jlab), Jefferson Laboratory, Newport News, Virginia, [32]
National Synchrotron Light Source (NSLS), Brookhaven National Laboratory, Upton, New York
Synchrotron Radiation Center (SRC), University of Wisconsin-Madison, Stoughton, Wisconsin
Stanford Picosecond FEL Center, Stanford University, Stanford, California, [33]
Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL), Stanford Linear Accelerator Center, Menlo Park, California
Synchrotron Ultraviolet Radiation Facility (SURF), National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, Maryland
W. M. Keck Vanderbilt Free-electron Laser Center, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee

8princess8[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75310
精华 1
积分 664
帖子 821
信誉分 103
可用分 5056
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态离线

发表于 2013-5-2 13:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

下面是一个 synchrotron 的示意图

附件

2013-5-2 13:39

91993372.jpg (73.34 KB)

koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态离线

发表于 2013-5-2 13:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知道是不是可以更加深入的讨论一些，或者更加的专业一些，感兴趣的战友可以继续看看。
简单的说一下NMR的原理。
NMR（核磁共振）nuclear magnetic resonance。A phenomenon in which transitionsin the magnetic energy states of the nuclei of atoms are induced when the atoms are placed in a static magnetic fieldand subjected to an oscillatory magnetic field, perpendicular to
the static field, and oscillating at some characteristic radio frequency.
简单的说就是，处于一个静磁场中的核子（质子和中子），会由于磁场的作用而处于不同的能量状态，当一个外界的摆动的磁场来扰动处于“平衡”状态的核子时，吸收了能量的核子就会从不同的能级之间要迁，并再此过程中会释放出能量。而放出的能量被检测到之后，经过分析和计算就可以得到蛋白质内部的原子的结构信息。
进一步解释一下：首先不是所有的原子都是有NMR现象的，也不是具有了NMR现象就可以用于蛋白结构解析。象O16，C12是没有核磁共振现象的（偶数的质子中子和偶数的电子），象H2，N14，NMR很难分析也很少研究。只有C13，N15，H1才真正的被用于研究，并用于结构解析。所以小一点的蛋白（小于10kd）因为含有足够的H，可以直接用来NMR分析，而更大的蛋白则需要同位素标记，就是在M9培养中，加入C13的葡萄糖，N15的NH4cl，然后诱导，从而是表达出来的蛋白中的原子都是具有NMR的C13，N15，H1。
NMR所用到的静磁场，是磁场非常强大的静磁场。例如750MHz的谱仪，它的静磁场是17.5T（特斯拉），这么强的磁场是通过电磁场产生的，我们知道螺旋线圈是可以产生磁场的，NMR所用的就是处于超导状态下的螺旋线圈中的电流产生的磁场，为了是线圈是超导，所用要将线圈放在液氦中，使温度接近绝对零度。所以NMR要消耗大量的液氦，还有液氮（放在液氦外面）。
所以NMR是很昂贵的试验，第一是样品需要同位素标记，第二是仪器非常贵重。

koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态离线

发表于 2013-5-2 13:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

找到一些晶体学的原理。一起学习。
蛋白质纯化与结晶
获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg)，其浓度通常在10 mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌(Escherichia coli)，在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。

在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。

蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的(图二)。

蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。

附件

2013-5-2 13:40

58007745.png (54.61 KB)

koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态离线

发表于 2013-5-2 13:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

绕射数据的记录
X 光绕射点搜集，随着时间的推移，也由早期以闪烁计数器(scintillation counter) 一次记录一个点及使用许多X-光片(X-ray film) 拍下绕射点，每张X 光片都要经过显影的步骤；之后进而使用多重金属丝板(multiwire)自动记录每次侦测到的绕射点。目前使用的荧光记录板(image plate)，则是利用磷化物经X 光激发后会产生荧光，经荧光扫描仪记录成数字模式的图像文件后，再以灯光照射一段时间去除记录板上的荧光点，即可再进行下一次的记录工作。电荷耦合器(charge-coupled devices, CCD) 的出现及技术的改良，可以不断地记录绕射点，而不需荧光板扫描及去除步骤，如此将加速绕射点的搜集。目前的同步辐射光源几乎全部使用CCD 来记录绕射数据(图三)。
在实验室中的X 光光源的产生，一般使用铜作为旋转式阳极靶(rotating anode)，可以产生波长为1.54 Å Cu Kα放射光。不过，以目前发表的文献来看，在同步辐射(synchrotron)光源所搜集的资料有增加的趋势，因为同步辐射所提供的X 光束，其强度较实验室强约百倍、甚至上千倍，同时它也可以改变不同频段的波长，以供非寻常散射(anomalous dispersion) 的实验研究

附件

2013-5-2 13:41

24227511.png (39.98 KB)

koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态离线

发表于 2013-5-2 13:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

绕射原理
单一分子在X 光下的讯号极弱，无法被记录下来，然而在晶体中通常是由许多排列整齐的蛋白质分子所组成，当晶体内所有的分子(数量约在1015 个以上)一起在同一个方向上进行绕射且绕射波皆同步时，即足以使所产生的讯号被记录下来。每一个绕射波的强度与其振幅(amplitude)的平方成正比。但绕射波的另一个变数，绕射波的相角(phase)，则无法直接测量得到，必须利用其他的方法方能获得(见相角决定方法)。若是绕射点振幅与相角都可获知，则可以进一步地来计算晶体中的电子密度图。
下列方程式即是著名的傅立叶转换公式，ρ表示在晶体中任何一个位置上(x, y, z) 的电子密度，φhkl 为绕射光相角，|Fhkl|为绕射光振幅，可由实验测得的绕射光强度开平方获得。

附件

2013-5-2 13:41

44722803.png (6.55 KB)

koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态离线

发表于 2013-5-2 13:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

所以若是记录了所有的绕射波的强度(h,k,l)，并计算出所有绕射光的相角，带入这个公式，蛋白质在晶体内的结构，就以电子密度图的方式呈现在我们的眼前了(图四)。
相角决定方法
决定相角通常有三种常用的方法，分别是同型置换法(isomorphous replacement method) 、非寻常散射法(anomalous dispersion method) 以及分子置换法(molecular replacement) ，现在分述如下：
(1）同型置换法
同型重原子置换法最早的应用是在1954 年，用来解出血红蛋白hemoglobin 的相角，需要在晶体蛋白质的内部加入重原子。通常以浸泡的方法使重原子能够渗透(diffuse) 进入到晶体内部和蛋白质结合。这些重原子对X 光产生较大的绕射，对绕射点的强度会有明显的差异，根据这些差异，可定出重原子的位置，并进而推算出蛋白质晶体绕射光的相角。理论上，若是只获得一组重原子衍生物数据(single isomorphous replacement, SIR)，经计算后，其解并不是唯一的；因此通常会结合数个不同的重原子衍生物所得到的数据(multiple isomorphous replacement, MIR)，来求得更精确的相角。
(2) 非寻常散射法
较重的原子会吸收特定波长的X 光，运用接近吸收边缘(absorption edge)的X 光进行绕射实验时，会产生不寻常的X 光散射或吸收现象，称为非寻常散射(anomalous scattering)，此一现象可导致绕射振幅及相角的改变。经由数个不同波长的X 光照射，记录吸收边缘前后所产生的不同绕射结果，可依此计算出相角。由于它使用数个不同波长，所以称为「多波长非寻常散射法」(multiwavelength anomalous dispersion, MAD) 。使用这个方法的前提是X 光的波长需依重原子的特性加以调整，而一般在实验室的X 光通常是属于固定波长的，并无法满足这个方法，所以非寻常散射法就需要利用同步辐射可变波长的光源来完成(5)。目前很多实验室使用硒化甲硫胺酸(selenomethionine)来取代甲硫胺酸 (methionine)，在养菌的同时加入硒化甲硫胺酸，使蛋白质的形成过程带入含有重原子硒的硒化甲硫胺酸，接下来养出蛋白质晶体，在硒的吸收边缘进行绕射实验，并运用MAD 的方法来计算出蛋白质晶体绕射波的相角(图四)。
(3) 分子置换法
若是一个未知的蛋白质与另一已解出结构的蛋白质，在胺基酸序列具有30 %以上的一致性(identity)，表示这两个蛋白质的结构可能类似，可以利用分子置换法来计算出未知蛋白质的相角。利用已知蛋白质之结构分子带入晶体中寻找旋转及位移的可能位置，解析出结构。随着蛋白质结构的增加，可以发现类似的蛋白质具有相同的折迭方式，而出现新的折迭的机率也相对减少，所以只要未知的蛋白质在蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB )中，找到序列上具有同源性(homology)的已知结构时，即可在取得晶体绕射数据后，快速地运用分子置换法来解决相角问题。

附件

2013-5-2 13:41

82587016.snap.jpg (31.4 KB)

koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态离线

发表于 2013-5-2 13:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

三维结构模型之建立及修正
藉由电子密度图的三维构形，可将每一个胺基酸依蛋白质序列建立蛋白质的起始模型。蛋白质的起始模型，常由于相角的解不够完美，使计算出来的电子密度图产生误差，误导模型的走向，因此需要做进一步的改善，称为修正(refinement)。修正的目的在于进行立体化学(stereochemistry)(如胜键键长、键角、胺基酸构形)优化的同时，减少计算与实验绕射点强度的差异，用来评估的数值则是「剩余值(R-factor)」：

其中Fobs 及Fcalc 分别表示观察值与计算值的绕射光振幅。尽可能将剩余值降到最低，直到进一步的修正无法减少其值为止，即达最终的蛋白质结构模型。大部分修正后可接受的剩余值约0.2 (20%)。但低的剩余值，并不代表其结构就是正确的。已有数个例子显示在蛋白质结构上的某些部分不正确时，仍可能获得较低的剩余值。因此Brünger (7)在1992 年提出一个交互验证的程序，也就是取出部分的绕射点(建议为10%)，排除于修正的程序之外，以对结构的正确性，提供个别的检查，称为「自由剩余值(R-free) 」，其计算方式同剩余值。

附件

2013-5-2 13:42

66728937.png (6.91 KB)

121 2/13 ‹‹1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ›››|