蛋白质与蛋白组学

请教版主：p-akt和p-erk的wb问题，我用碧云天的Western及IP细胞裂解液（主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂），另加PMSF，裂解细胞，之后检测p-akt和p-erk，结果什么条带也没有，背景黑黑的。请指点迷津！谢谢！

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对照蛋白如actin，GADPH等的结果能出来吗？或者，您做其它蛋白的WB有没有问题？这是为了排除你的WB技术及试剂原因造成的无结果。

谢谢版主，我已经与经销商联系了。另外，再问个问题，eNOS的条带在暗室中肉眼可见，曝出来也很亮，背景很干净，没有看到其它条带，这种情况非特异性条带存在的可能性大吗？还有，要怎样才能证明这条带是否为非特异性条带呢？

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您说的这种情况下，非特异性条带存在的可能性也很大。认为非特异性条带主要有3点：1，离目的条带的分子量很远；2，任何处理下其条带差异不大。3，与阳性对照（已经有人做出来的目的蛋白）明显有差别。当然，一般情况下，有时只要第1点就可判断。

有战友问：磷酸化后分子量会变吗？我做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起，谢

回答：磷酸化后分子量会增加一些，即增加几个磷酸根的分子量而已，相对几十KD的蛋白而言影响不大，所以条带应该在相同位置。如果您做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起时，其中的一个原因可能是您看到的是抗体的非特异性条带，而其特异性条带没有出现。

个人认为这个主要取决于蛋白的磷酸化程度，尽管大多数蛋白磷酸化后分子量并无明显变化， 但也有一些蛋白由于高度磷酸化，即使分子量相对较小，磷酸化蛋白和总蛋白相比也有很大的变化，一个明显的例子就是calcineurin, 这个已经有很多报道了。另外一个有意思的事情就是：尽管磷酸化蛋白和总蛋白相比，尽管一般磷酸化蛋白的表观分子量更大，但是也个别相反的例子。“磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起”这个很正常， Li-Cor的Odyssey imaging system 的使用说明书中举的一个例子就是可以同时检测p-ERK and total ERK，两者的位置明显不同，尽管差别不像p-calcineurin and total calcineurin那么大。希望上述信息对新手甚至老手也有帮助，祝大家好运！

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根据我的理解，p-ERK and total ERK应该在相同的位置，Odyssey imaging system之所以能同时检测，那是因为采用了不同的荧光的缘故。

对照蛋白如actin，GADPH等的结果能出来吗？或者，您做其它蛋白的WB有没有问题？这是为了排除你的WB技术及试剂原因造成的无结果。

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别的都没问题，就磷酸化的WB出不来。提蛋白时感觉挺小心的，不知道那步出问题了，有时候会曝出一些细细的杂带，可目的带就是出不来，我都快疯了！

谢谢版主及时回复！别的都没问题，就磷酸化的WB出不来。提蛋白时感觉挺小心的，不知道那步出问题了，有时候会曝出一些细细的杂带，可目的带就是出不来，我都快疯了！

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最大的可能有2个：1，一抗效果不好；2，提取蛋白的过程有点问题。
所以，1，向厂商要阳性对照，或者向实验室同仁要一些他们以前做出来过的样品来验证一下。
2，尽量保持低温。

本人做了磷酸化蛋白的WB有几个月了，一开始得出的结果却发现是非特异性条带，差点崩溃掉。
昨天再做了一次WB。具体过程如下，请大侠们指教：
提取样品：
预冷的PBS清洗3次，细胞刮收集细胞，4度离心5分钟后，加入裂解液（含有ROCHE的蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，PMSF),冰上裂解30分钟，4度离心15分钟收集上清液。
蛋白变性：
提取蛋白后立即加入RIPA及Loading buffer,100度变性5分钟，短暂离心，﹣80度保存
电泳：
Sep GEL 7%过夜
stack gel 80伏 18分钟
sep gel 100伏 80分钟
转膜
PVDF膜活化5分钟
转膜 100伏 3h
TBS 15min 3次
封闭液
5%脱脂牛奶（完全按照一抗说明书）1h
blotting buffer(按照一抗说明书配置) 15min 3次
一抗（按说明书配置） 4度 过夜
blotting buffer 15min 3次
二抗（中杉金桥）1h
blotting buffer 15min 3次
ECL 发光液+H2O2 2 min
曝光

结果发现，连beta-actin 都没有条带，甚至在暗房中也没看见发光

请各位大侠帮忙分析一下吧
再不出结果，老板就会。。。

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我们提取样品的过程是这样的：
收集细胞（贴壁）于预冷的PBS洗三遍，然后置于冰上，加入裂解液裂解一个小时左右，大皿200UL，小皿100UL。（具体裂解液加多少根据你细胞密度来调节，否则测出来的蛋白浓度或低或高）。裂解的过程中注意在冰上均匀晃动，使裂解液能裂解到每个细胞。然后用细胞刮，将细胞收集起来，4°离心机离心15分钟，取上层上清液，测蛋白浓度即可。

请教版主：p-akt和p-erk的wb问题，我用碧云天的Western及IP细胞裂解液（主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂），另加PMSF，裂解细胞，之后检测p-akt和p-erk，结果什么条带也没有，背景黑黑的。请指点迷津！谢谢！

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我也是啊，出来的就是杂带，目的条带一点也看不到，完全搞不懂是什么问题！！！

有战友问：加入millipore substrate后，曝片，在目的条带位置膜上出现 发黄色的条带，是什么原因，信号过强吗？出现这样的情况，再去曝X片，对实际结果有影响吗？

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回答：

这是信号过强造成的。如果出现这样的情况，要尽快压片，或者下次实验时，蛋白上样量适当减少一些。