蛋白质与蛋白组学

磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂的同时还需要加入蛋白酶抑制剂及PMSF

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没错。PMSF也是蛋白酶抑制剂的一种。

磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂的同时还需要加入蛋白酶抑制剂及PMSF

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版主说得没错。另外，PMSF也是蛋白酶抑制剂的一种。

我做了一年的WB，其中有很多磷酸化的，一些经验教训：

1. 正像楼主所说，抗体选择很重要，而且最最重要。好抗体，傻瓜也能做出来，不好的抗体神仙也无办法。有些公司的抗体很好，有些公司的抗体很差（一些大公司同样会有低劣产品），而且这一点对非磷酸化的抗原检测也很重要。
2. 标本收集要在冰上，保持低温。我没有用磷酸酶抑制剂，没有比较过用和不用的区别，但结果总体来说还可以。
3. 我们实验室对于磷酸化蛋白的检测，封闭必用5%BSA，而不用脱脂奶粉，道理讲不清，上面流传下来的方法，可能对于敏感性和特异性差的抗体会有帮助。一抗用1%BSA稀释，先1：1000 稀释，后根据情况调整。
4. 我们只有做IP的时候才用蛋白酶抑制剂。

又看了楼主过去的帖子，很佩服，楼主是个热心人。做过此类实验后，再看你的WB经验，既有同感有学习了很多。投上一票，聊表敬意！

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谢谢分享经验。没有用磷酸酶抑制剂，在磷酸化蛋白的量较多（如MAPK），且一抗质量较好时可能影响不大,其它时候影响都很大，尤其是一些不太好做的磷酸化蛋白。个人经验，封闭用5%BSA比脱脂奶粉要好一些，但不会好太多。一抗用1%，3%，5%BSA这三个浓度稀释，效果都还可以，但我个人使用的经验是5%BSA稀释的抗体reuse的次数会更多一些。
建议还是加蛋白酶抑制剂为好，个人经验，加了以后的实验结果相对稳定一些。

做Western很久了，但是做磷酸化的抗体也是近几个月的事情，有两点经验与大家分享：
1. 抗体的说明书大家一定要仔细看，非常重要，因为不同的磷酸化抗体公司推荐的protocol不同，比如upstate的gamma-H2AX就需要non-fat milk封闭，一抗、二抗也需要non-fat milk配置，而CST的一些抗体则是non-fat milk封闭，一抗、二抗用BSA配置。其中原因不详，但是应该是非常关键的，我试过用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的条带非常淡。
2. 蛋白收集，洗涤贴壁细胞后，直接加1X上样缓冲液，超声后煮沸，不需要其他的磷酸酶抑制剂，效果不错。简单容易操作，适合新手。
3. 洗涤对最后的背景影响也较大，millipore最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，效果很明显，具体：1st and 2nd抗体之间，DDW 5min X3次，2nd抗体后，DDW 5min X3次，TBST 5min X1次，DDW rinse 3-4次。我对比了TBST洗涤的membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使压片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，DDW充分减少了ECL反映中其他缓冲的影响，应该是可取的。

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谢谢分享经验。对于第2点，我也这样做过，效果不错，只是有两点要注意：1，不容易测蛋白浓度，所以定量上相对不准确；2，因为相对而言要加的1X上样缓冲液较多，所以蛋白浓度可能较稀，对一些较少量的蛋白之WB可能不适合。
对于第3点，这可能是个不错的方法，我担心的是目的蛋白或者抗体会不会被DDW洗脱，影响结果？期待同仁能证实或排除这一点。

对于第2点，我也这样做过，效果不错，只是有两点要注意：1，不容易测蛋白浓度，所以定量上相对不准确；2，因为相对而言要加的1X上样缓冲液较多，所以蛋白浓度可能较稀，对一些较少量的蛋白之WB可能不适合。

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1. 我定量的时候，空白对照用等体积1X上样缓冲，这样基本排除了定量误差，而且这一点已经用beta-actin等内参得到证实。
2. 这一点确实如此，特别是对于细胞密度较低或者所用培养皿较小的细胞，不过，我6cm的dish加入150ul 1X上样缓冲，完全没有问题，我用的细胞比较大，密度一般，因此应该适用于大多数的情况。

对于第3点，这可能是个不错的方法，我担心的是目的蛋白或者抗体会不会被DDW洗脱，影响结果？期待同仁能证实或排除这一点。

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这点已经有文献报道过，而且我自己试过至少30种抗体（不同公司，包括CST磷酸化抗体）都没有问题，改天有空，我做一个平行对照，看看差距。