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标题:【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见

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发表于 2013-5-2 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做Western很久了，但是做磷酸化的抗体也是近几个月的事情，有两点经验与大家分享：
3. 洗涤对最后的背景影响也较大，millipore最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，效果很明显，具体：1st and 2nd抗体之间，DDW 5min X3次，2nd抗体后，DDW 5min X3次，TBST 5min X1次，DDW rinse 3-4次。我对比了TBST洗涤的membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使压片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，DDW充分减少了ECL反映中其他缓冲的影响，应该是可取的。

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第三点中是你自己亲自实验对比后的结果吗？
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发表于 2013-5-2 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第三点中是你自己亲自实验对比后的结果吗？

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是的，但是没有做“头对头”比较，只是前后两次，一次用TBST洗，一次用DDW洗，但是前后差异很小，因为实验室是恒温的，而且是同一批样品，做出来的背景DDW洗的更好，所以推荐给大家。
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 小中大
是的，但是没有做“头对头”比较，只是前后两次，一次用TBST洗，一次用DDW洗，但是前后差异很小，因为实验室是恒温的，而且是同一批样品，做出来的背景DDW洗的更好，所以推荐给大家。

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昨天我试了一次
在二抗进行ECL孵育前如果用DDW洗的话背景是很干净，但是HRP催化底物的能力几乎丧失了
后来用TBST重新洗膜后加上ECL孵育，能曝出条带
供你参考
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发表于 2013-5-2 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也这样试了一下，与uk版主所看到的类似，背景很干净，但条带也很弱。
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 小中大

磷酸化抗体当然不能使用脱脂奶，因为脱脂奶含磷酸化蛋白丰富，是奶中磷元素的来源之一。 但多肽序列特异的磷酸化抗体一半不受脱脂奶的影响。。双磷酸化MAPK （such as ERK1/2, JNKs, p38 MAPK)抗体很少受脱脂奶影响。信号变弱是因为脱脂奶可能会影响抗体进入固定于膜上的抗原而已。4度过夜好，主要原因不是抗体结合更好，而是蛋白抗原不容易从膜上脱落。 蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。而但抗体-抗原结合是热力学与动力学问题，高温容易结合是热力学范畴，抗体抗原浓度却是动力学范畴。 膜上的抗原脱落了，结合效率会低。
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发表于 2013-5-2 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂的同时还需要加入蛋白酶抑制剂及PMSF

好像PMSF很容易失活，许多WB达人在将组织裂解时，均交代要反复多次添加PMSF，请问裂解及提取上清并进行分装，以后在使用时还要添加PMSF吗？
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发表于 2013-5-2 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 抗体的说明书大家一定要仔细看，非常重要，因为不同的磷酸化抗体公司推荐的protocol不同，比如upstate的gamma-H2AX就需要non-fat milk封闭，一抗、二抗也需要non-fat milk配置，而CST的一些抗体则是non-fat milk封闭，一抗、二抗用BSA配置。其中原因不详，但是应该是非常关键的，我试过用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的条带非常淡。

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说得没错，CST的一些抗体则是non-fat milk封闭，我试过用BSA配制，背景很脏。
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发表于 2013-5-2 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像PMSF很容易失活，许多WB达人在将组织裂解时，均交代要反复多次添加PMSF，请问裂解及提取上清并进行分装，以后在使用时还要添加PMSF吗？

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我只在配制时添加，之后就不再加了。
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 小中大
好像PMSF很容易失活，许多WB达人在将组织裂解时，均交代要反复多次添加PMSF，请问裂解及提取上清并进行分装，以后在使用时还要添加PMSF吗？

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我的方法基本同楼上回答

PMSF在溶液中降解是30min左右

PMSF在溶液中与蛋白酶是呈不可逆结合
后续分装的过程是不需要加的
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发表于 2013-5-2 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
昨天我试了一次
在二抗进行ECL孵育前如果用DDW洗的话背景是很干净，但是HRP催化底物的能力几乎丧失了
后来用TBST重新洗膜后加上ECL孵育，能曝出条带
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谢谢您补充实验，我想可能是实验条件及抗体的差异吧，您这样做肯定更有说服力，所以我也不推荐所有的抗体都用DDW洗了。
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