蛋白质与蛋白组学

另外再请问下，
1.在磷酸化蛋白一抗（5%BSA稀释)中加叠氮钠以增加反复使用次数合适吗？
2.添加后在4度冰箱中能放多久？
3.记得llllcjchina大侠在上次贴中曾提到一抗稀释后要放置-20度保存，哪添加叠氮钠后还需要放置-20度吗？
4.添加叠氮钠后的一抗在重复使用时需补充少量一抗吗？以前师兄曾告诉我，叠氮钠会使一抗效价下降或损耗一抗，是这样的吗？
谢谢！

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回答：
1，个人感觉，叠氮钠并不能很好地增加一抗的使用次数。而且叠氮钠会抑制HRP活性，我自己觉得没必要加。
2，稀释后的一抗建议不要放在4度冰箱太久，要放置-20度保存。
3，叠氮钠可以抑菌，稳定抗体，添加叠氮钠后稀释后的一抗在4度可以保存略久一些，但它确实可以使稀释后的抗体效价一降。
总之，我不建议在稀释后的抗体中加叠氮钠。

本人做了磷酸化蛋白的WB有几个月了，一开始得出的结果却发现是非特异性条带，差点崩溃掉。
昨天再做了一次WB。具体过程如下，请大侠们指教：
提取样品：
预冷的PBS清洗3次，细胞刮收集细胞，4度离心5分钟后，加入裂解液（含有ROCHE的蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，PMSF),冰上裂解30分钟，4度离心15分钟收集上清液。
蛋白变性：
提取蛋白后立即加入RIPA及Loading buffer,100度变性5分钟，短暂离心，﹣80度保存
电泳：
Sep GEL 7%过夜
stack gel 80伏 18分钟
sep gel 100伏 80分钟
转膜
PVDF膜活化5分钟
转膜 100伏 3h
TBS 15min 3次
封闭液
5%脱脂牛奶（完全按照一抗说明书）1h
blotting buffer(按照一抗说明书配置) 15min 3次
一抗（按说明书配置） 4度 过夜
blotting buffer 15min 3次
二抗（中杉金桥）1h
blotting buffer 15min 3次
ECL 发光液+H2O2 2 min
曝光

结果发现，连beta-actin 都没有条带，甚至在暗房中也没看见发光

请各位大侠帮忙分析一下吧
再不出结果，老板就会。。。

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blotting buffer是什么？是TBST吗？
如果连actin都没有条带的话，原因就有很多了，所以就无从给你建议了。
也有可能是哪一个试剂变质了。

发现没有结果后，我用0.1%NaOH洗膜5min ，TBS 15min 3 次
5%BSA封闭（因为本次用的一抗CST建议使用BSA)1h
TBST 15min 3 次
一抗（按CST的要求配置5%BSA稀释）4度过夜
明天准备改用ODYSSEY来看
祈求明天会看到东西

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我没有用0.1%NaOH洗膜过，我不知可行不可行。
建议您先压好做一点的actin吧，实验要一步一步做，先把actin做不出来的原因找到。

我没有用0.1%NaOH洗膜过，我不知可行不可行。
建议您先压好做一点的actin吧，实验要一步一步做，先把actin做不出来的原因找到。

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同意你的说法

我试过NaOH洗膜
这种方法行不通

我是做p-akt的，做来作去胶片都是空白，昨天按照建议，洗涤时间缩短，膜上亮了一片，一压胶片就全曝光了，根本看不出条带了。请问有什么建议?很急，请帮帮忙啊！

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你以前做都是空白，现在洗涤时间缩短，却膜上亮了一片。如果只是洗涤时间缩短的话，按理说不应该如此的。那您洗多短时间？几次？有可能您这次的其它条件改变了，而您不知道，请查一下这次实验有什么操作或试剂改了。