蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 471  5/48 |‹‹‹3456789101112›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见

04906[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73544
精华 0
积分 599
帖子 858
信誉分 100
可用分 5155
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
41

发表于 2013-5-2 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢两位大侠的帮忙
我决定今天把所有液体都配过
重新再做
顶部
98776langtao[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74068
精华 0
积分 275
帖子 290
信誉分 100
可用分 2191
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
42

发表于 2013-5-2 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你以前做都是空白，现在洗涤时间缩短，却膜上亮了一片。如果只是洗涤时间缩短的话，按理说不应该如此的。那您洗多短时间？几次？有可能您这次的其它条件改变了，而您不知道，请查一下这次实验有什么操作或试剂改了。

=======================================================================================

还有就是一抗用5%BSA TBST稀释的，因为才看到说明书上这么要求，以前都是5%no-fat milk TBST稀释的。
顶部
98776langtao[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74068
精华 0
积分 275
帖子 290
信誉分 100
可用分 2191
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
43

发表于 2013-5-2 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

洗涤是5min/次，洗三次，一抗是过夜的，二抗37度1小时
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
44

发表于 2013-5-2 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
洗涤是5min/次，洗三次，一抗是过夜的，二抗37度1小时

=============================

二抗室温1小时即可，不用37度。
顶部
98776langtao[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74068
精华 0
积分 275
帖子 290
信誉分 100
可用分 2191
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
45

发表于 2013-5-2 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二抗室温1小时即可，不用37度。

========================================================

谢谢啦，那如果暗室能看到信号，压片却没条带，一般是什么原因呢？
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
46

发表于 2013-5-2 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢啦，那如果暗室能看到信号，压片却没条带，一般是什么原因呢？

=========================================================================

这种可能性很小，我还没见过这样的。X光片过期了？如果X光片提前曝光则应是全黑的才对。
要不然就是洗片的试剂出问题了。
顶部
98776langtao[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74068
精华 0
积分 275
帖子 290
信誉分 100
可用分 2191
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
47

发表于 2013-5-2 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2013-5-2 17:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢啦，那如果暗室能看到信号，压片却没条带，一般是什么原因呢？

=========================================================================

这种可能性很小，我还没见过这样的。X光片过期了？如果X光片提前曝光则应是全 ...

上次就怀疑是显影液或定影液问题，所以换了，结果就一压全曝光了，以为是胶片问题，就拿胶片直接显影、定影，胶片没有曝光，还是蓝色透明的，每次问题都不一样，真快崩溃了哈！
顶部
04906[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73544
精华 0
积分 599
帖子 858
信誉分 100
可用分 5155
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
48

发表于 2013-5-2 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再请问一个关于提取核蛋白组织样品的制备的问题。
有方法推荐：对于一般组织，可以称量后切成小块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理）加入Laemmli样品缓冲液强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。
对于脑组织，是否可以通过液氮冷冻、研磨后，加裂解液后再予超声处理，再加入Laemmli样品缓冲液、煮沸5分钟后提上清保存或上样呢？对于提核蛋白来说，经超声、煮沸处理是否更有效？
顶部
04906[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73544
精华 0
积分 599
帖子 858
信誉分 100
可用分 5155
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
49

发表于 2013-5-2 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，对磷酸化蛋白来说，上述处理（液氮冷冻、研磨后，加裂解液后再予超声处理，再加入Laemmli样品缓冲液、煮沸5分钟后提上清保存）合适吗？
顶部
kuohao17[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77299
精华 0
积分 559
帖子 716
信誉分 101
可用分 4453
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
50

发表于 2013-5-2 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像PMSF很容易失活，许多WB达人在将组织裂解时，均交代要反复多次添加PMSF，请问裂解及提取上清并进行分装，以后在使用时还要添加PMSF吗？

==============================================================================================================

我们实验室一般是把细胞裂解液配好以后分装成1ml/支，-20度或者-60度保存，临用前再添加PMSF和cocktail，整个样品处理过程全部在冰上或者4度进行。
顶部
 471  5/48 |‹‹‹3456789101112›››|