蛋白质与蛋白组学

再请问一个关于提取核蛋白组织样品的制备的问题。
有方法推荐：对于一般组织，可以称量后切成小块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理）加入Laemmli样品缓冲液强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。
对于脑组织，是否可以通过液氮冷冻、研磨后，加裂解液后再予超声处理，再加入Laemmli样品缓冲液、煮沸5分钟后提上清保存或上样呢？对于提核蛋白来说，经超声、煮沸处理是否更有效？

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提取核蛋白我用的是kit (PIERCE NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents)。

另外，对磷酸化蛋白来说，上述处理（液氮冷冻、研磨后，加裂解液后再予超声处理，再加入Laemmli样品缓冲液、煮沸5分钟后提上清保存）合适吗？

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超声波的时间和强度要控制好，过量对磷酸化蛋白影响很大。

我在做ERK磷酸化的WB.封闭用的是5%脱脂奶粉，一抗是cell signaling的，稀释度按照他的说明书1：2000稀释，用碧云天的一抗稀释液稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给点建议，谢谢。

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cell signaling的p-ERK一般应该1：1000，而且要含5%BSA之TBST配.否则，1，条带不清晰，2，reuse的次数减少，至少不能reuse.

今天终于如愿以偿作出了自己想要的条带！
好羡慕啊！我什么时候才能做出来啊？希望版主能就sample的制备给点建议，非常感谢！

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建议您先用actin等一些好做的蛋白先把您的WB技术练好，找到出错原因所在后再做磷酸化蛋白。