蛋白质与蛋白组学

你用刮细胞的方式我也做过，但我会冰上裂解30min,不进行超声波处理，直接离心取上清。
你问的“您说测蛋白后冰浴30min（然后离心取上清），这个冰浴的作用是什么？”应该是您看错了。我是冰浴30min充分裂解细胞，离心后取上清，然后测蛋白。
而用trypsin处理有个好处是蛋白浓度较高，但要注意保持低温。p-ERK活化当然有时间上的峰值，但trypsin如果处理得好，不会影响其活化的，至少在我手中是如此。我比较这两种方法发现，刮细胞的方式简单，但蛋白浓度较低；而用trypsin方式所得蛋白浓度较高，但要小心处理，否则磷酸化蛋白容易失活。各有优缺点。

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A quick question:
when I boil the sample with loading buffer at 95 degree C, is 15min too long?
Usually I use 5 min, but yesterday I boiled 15min by mistake. and nothing showed up on the membrane.

我在做ERK磷酸化的WB.封闭用的是5%脱脂奶粉，一抗是cell signaling的，稀释度按照他的说明书1：2000稀释，用碧云天的一抗稀释液稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给点建议，谢谢。

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我想到的可能有这几点：
1，分子量ladder有没有荧光？显影？
2， 如果ladder没有显影，查看膜有没有反了。
3，样本有没有加磷酸酶抑制剂?
4，跑胶之前样本可以再次煮沸以确保蛋白变性。煮沸样本之前一定要一直保持低温操作，且时间越短越好。
5。前一次使用一抗有没有及时放回冰箱？可能一抗失效，但是几率不大。

1、ladder没有荧光，也没有显影。
2、膜是做了标记的，不会弄反。
3、抽蛋白是用Fermentas的细胞蛋白抽取液，没有额外加磷酸酶抑制剂。蛋白是变性后-80°保存。第一次拿出来跑western是在相应分子量的地方有条带的。
4、以前上样之前都不再把蛋白拿来煮的。这几天和另外一个老师交流，他说要煮。
5、一抗是新鲜的。

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1, do you see visible marker (blue ladder)?
2, ECL expired?
3, you can check internal control by stripping the membrane and incubate with actin or total Erk antibody.
Or, simply stain the membrane with gel gold.

我一般用5min,10min以内都还可以。15min实在太长了，我没试过，请测试过的同仁发表一下意见，谢谢！

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I loaded more protein (80ug) and exposed for 15min. Bands of p-Erk showed up, but definitely much weaker than what I had before.