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标题:【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见

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发表于 2013-5-4 12:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 yapuyapu 于 2013-5-4 12:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


您好 我说的不是那种蛋白酶抑制剂。我是做VEGFR-2磷酸化与血管新生，现在要定VEGFR-2磷酸化抑制剂，但有很多位点的磷酸化抑制剂，比如Y951，Y1175，Y1054，Y1059等，我不知道该选那个，文献上也没怎么查到。请楼主赐教！ ...

我没用过VEGFR-2磷酸化抑制剂，所以只能凭自己用其他抑制剂的经验说明一些。
我一般会购买文献中使用的最多的抑制剂，同时也购买相应的目的蛋白的磷酸化抗体，然后用抗体测试抑制的效果，如果抑制效果还可以就继续使用，否则就买另一种抑制剂。
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发表于 2013-5-4 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢楼主 的帮助与指导，我的p-eNOS做出来了，换了个二抗，真是郁闷！但现在有个问题是杂带多，背景脏，请教楼主该如何解决呢?谢谢！另外我们有个同学做的条带都是呈点状、竖条状，乍一看象条形码一样，重复多次，改进条件都不好，这是什么原因呢？该如何解决？感谢！
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发表于 2013-5-4 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 am10 于 2013-5-4 12:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

感谢楼主 的帮助与指导，我的p-eNOS做出来了，换了个二抗，真是郁闷！但现在有个问题是杂带多，背景脏，请教楼主该如何解决呢?谢谢！另外我们有个同学做的条带都是呈点状、竖条状，乍一看象条形码一样，重复多次，改进条件都不好，这是什 ...

p-eNOS的WB结果杂带多，背景脏，最大的可能是一抗的问题（尤其是杂带多），其次是提取蛋白过程的问题。改善的方法是：提取蛋白时尽量低温且快速一点；最好当然是换一个好一点的抗体。另外，建议你所用的reagent采用你们实验室WB结果不错的那一批，以排除是reagent出现的问题。
你们同学的WB结果如果是整个胶片是满天星星的样子，那是一抗的问题。如果是各条带时断时好，最大的可能有两点：1，你们同学跑胶时经常漏running buffer；2，某一个reagent变质了。
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发表于 2013-5-4 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用牛奶封闭后，在TBST里震荡几下就行，不用洗那么长时间，否则封闭就没用了
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 小中大

请教大家一个问题，收的细胞蛋白，冻在-80度，能放多长时间？反复冻容几次就不行了？谢谢？
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 小中大

还有个问题，就是用抗鼠的二抗，发完光以后，在GAPDH下还有一条带，还挺清楚，请教一下这是怎么回事！谢谢大家
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发表于 2013-5-4 12:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 韩梅梅 于 2013-5-4 12:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用牛奶封闭后，在TBST里震荡几下就行，不用洗那么长时间，否则封闭就没用了

应该不是震荡（vortex）,而是shaking.
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 小中大


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原帖由 韩梅梅 于 2013-5-4 12:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教大家一个问题，收的细胞蛋白，冻在-80度，能放多长时间？反复冻容几次就不行了？谢谢？

冻在-80度至少可以一年，但反复冻融次数要尽量少，最好5次以下。
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发表于 2013-5-4 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 韩梅梅 于 2013-5-4 12:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还有个问题，就是用抗鼠的二抗，发完光以后，在GAPDH下还有一条带，还挺清楚，请教一下这是怎么回事！谢谢大家

non-specific binding,很多抗体都有此现象。
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发表于 2013-5-4 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，你有没有做过组织的p-protein western,有没有从裂解开始的protocol?谢谢
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