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标题:【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见

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发表于 2013-5-4 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有，我已在我之前的贴子里贴出了一些细节，但我没有放在一起，麻烦您看完这个贴子和之前的贴子后自己摘录您自己需要的部分。
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发表于 2013-5-4 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

超声破碎对p-AKT影响可能不大，我的MEF细胞样品，BioRuptor 200W 超声30秒，间歇30秒，10个循环。p-AKT(S473, Cell signalling)信号很强，曝光只需1秒。
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发表于 2013-5-4 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 vcve 于 2013-5-4 12:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

超声破碎对p-AKT影响可能不大，我的MEF细胞样品，BioRuptor 200W 超声30秒，间歇30秒，10个循环。p-AKT(S473, Cell signalling)信号很强，曝光只需1秒。

我要补充一点：p-AKT以及p-MAPK等大量表达磷酸化蛋白的对超声波可能影响小一些，但超声波对磷酸化蛋白一定会造成影响，只是影响大小不同而已，这一点请务必注意。
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发表于 2013-5-4 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们想做p-ERK和p-AKT的western，请问楼主磷酸酶抑制剂能不能只加NaF？钒酸钠有的前辈激活了有的直接溶了就用，所以不知道到底该怎么处理。请问NaF还需要特殊处理吗？
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发表于 2013-5-4 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问版主，我做的iNOS,eNOS的WB，可是出来的条带都在55kDa左右，而不是预定的135kDa,一抗用的是abcam的，不知道是什么原因，还望不吝赐教。
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发表于 2013-5-4 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xingyi08 于 2013-5-4 12:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们想做p-ERK和p-AKT的western，请问楼主磷酸酶抑制剂能不能只加NaF？钒酸钠有的前辈激活了有的直接溶了就用，所以不知道到底该怎么处理。请问NaF还需要特殊处理吗？ ...

NaF不需要特殊处理，只加NaF当然也可以，只是没有与钒酸钠联用的效果那么好。钒酸钠要激活一下效果会好一些。
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发表于 2013-5-4 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 BOSS2011 于 2013-5-4 12:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问版主，我做的iNOS,eNOS的WB，可是出来的条带都在55kDa左右，而不是预定的135kDa,一抗用的是abcam的，不知道是什么原因，还望不吝赐教。


有可能是非特异性条带，建议您与厂商联系进行troubleshooting，也可以自己找一个阳性对照试一下。
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发表于 2013-5-4 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教版主：p-akt和p-erk的wb问题，我用碧云天的Western及IP细胞裂解液（主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂），另加PMSF，裂解细胞，之后检测p-akt和p-erk，结果什么条带也没有，背景黑黑的。请指点迷津！谢谢！
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发表于 2013-5-4 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢版主，我已经与经销商联系了。另外，再问个问题，eNOS的条带在暗室中肉眼可见，曝出来也很亮，背景很干净，没有看到其它条带，这种情况非特异性条带存在的可能性大吗？还有，要怎样才能证明这条带是否为非特异性条带呢？
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 小中大

有战友问：磷酸化后分子量会变吗？我做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起，谢

回答：磷酸化后分子量会增加一些，即增加几个磷酸根的分子量而已，相对几十KD的蛋白而言影响不大，所以条带应该在相同位置。如果您做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起时，其中的一个原因可能是您看到的是抗体的非特异性条带，而其特异性条带没有出现。

个人认为这个主要取决于蛋白的磷酸化程度，尽管大多数蛋白磷酸化后分子量并无明显变化， 但也有一些蛋白由于高度磷酸化，即使分子量相对较小，磷酸化蛋白和总蛋白相比也有很大的变化，一个明显的例子就是calcineurin, 这个已经有很多报道了。另外一个有意思的事情就是：尽管磷酸化蛋白和总蛋白相比，尽管一般磷酸化蛋白的表观分子量更大，但是也个别相反的例子。“磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起”这个很正常， Li-Cor的Odyssey imaging system 的使用说明书中举的一个例子就是可以同时检测p-ERK and total ERK，两者的位置明显不同，尽管差别不像p-calcineurin and total calcineurin那么大。希望上述信息对新手甚至老手也有帮助，祝大家好运！
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