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标题:【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

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发表于 2013-5-8 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过多次，玻璃纤维没有用过，但滤纸过滤是绝对除不干净的，还会引起一定的乳化作用。

=============================================================

呵呵，除石蜡不用那么麻烦吧，就能去掉，滤纸、玻璃纤维等都可以用的；
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发表于 2013-5-8 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那我想请问，你们所用稀释液怎么配置的啊？！

=====================================================================

稀释液要看用途的，不同的需要用不同的组分

如果只是稀释一下腹水样品，可以用PBS或者纯水，如果抗体丰度低，不推荐稀释很多倍

抗体浓度太低，影响过柱时的结合
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发表于 2013-5-8 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我对抗体纯化的看法是：不用亲和柱，离子交换柱、疏水柱、羟磷灰石等足以纯化任何抗体，而且费用低廉，又高效。
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发表于 2013-5-8 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近实验室做了些兔多抗，染出来特异性很差，杂带多而且很亮，想纯化一下又没有经验，请问楼主
1我们没有染出目的条带，不知道做完纯化能不能实现从无到有
2有两条杂带每次都有，在55KD-72KD一条，42KD-55KD一条，以楼主经验看，这是什么带啊，什么原因
3不知道抗体纯化对技术要求怎么样，我们没有做过的这种实验。
4楼主有没有比较推荐的详细步骤
5看了楼主是公司的大牛了，实验室以后还要制备抗体，不知道楼主对抗体制备和纯化的公司和条件有没有什么推荐
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发表于 2013-5-8 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 TNT 于 2013-5-8 15:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近实验室做了些兔多抗，染出来特异性很差，杂带多而且很亮，想纯化一下又没有经验，请问楼主
1我们没有染出目的条带，不知道做完纯化能不能实现从无到有
2有两条杂带每次都有，在55KD-72KD一条，42KD-55KD一条，以楼主经验看，这是 ...

您指的兔多抗染出来是拿兔血清直接做的WB?

1,血清当一抗直接做WB，如果没有主带，纯化后有可能做出来，特异性的抗原亲和纯化可以起到一定的浓缩作用，但是也有可能做不出来，毕竟纯化不是万能的。

另外对于WB，我想建议的是，如果有抗原蛋白，最好拿抗原蛋白跑胶做阳性对照，其次拿细胞裂解液或者组织裂解液做筛选，如果一种细胞裂解液做了好几次都失败，阳性CONTROL每次都出来，可以考虑换几个细胞株的裂解液试试。

2，你说的杂带，最好把图贴出来，标明裂解液

3，4抗体纯化做做是不难，只要一路都顺利。详细的PROTOCOL坛子里应该有，可以搜索一下。

5，制备抗体，如果自己有建立平台和靠抗体制备发文的需求，那不管多难都要自己做的；如果只是短时间需要用到，买又买不到，可以考虑外包给专业的公司做。
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发表于 2013-5-8 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问楼主，就是我做抗原亲和纯化抗血清，用pH2.5 Gly洗脱时，前2管总是有沉淀，您说沉淀是什么呀？
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发表于 2013-5-8 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 plaa 于 2013-5-8 15:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想问楼主，就是我做抗原亲和纯化抗血清，用pH2.5 Gly洗脱时，前2管总是有沉淀，您说沉淀是什么呀？

多抗比单抗容易沉淀，不同的抗体，互相聚集沉淀的最低浓度是不一样的。

你这个可能刚好碰到这个抗体比较容易沉淀。

你可以改变这个洗脱液的PH ，其实3就够了，没必要非2.5不洗。

另外可以减慢点洗脱流速，让抗体在配基上缓慢脱落，或者减少一次上样量。

预防为主，这样的沉淀，大部分后期是无法复容的。

其他方法也有，比如加甘油什么的，但是我觉得添加剂这个东西，看后期实验需要，有时能不加最好不加
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发表于 2013-5-8 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您是说沉淀的肯定是我的抗体吗？
而且沉淀只能扔掉是吧？
怎样减慢洗脱速度呢？我是靠重力流出的。
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发表于 2013-5-8 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 DDD 于 2013-5-8 15:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您是说沉淀的肯定是我的抗体吗？
而且沉淀只能扔掉是吧？
怎样减慢洗脱速度呢？我是靠重力流出的。

只要你上完样，平衡柱子彻底（10倍柱体积以上），那沉淀的一般都是抗体，而且多抗发生这种情况居多。

像你这种重力流的，流速已经很慢了，那你就减少些单次血清上样量，多纯化几次也一样能拿到大部分抗体
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 小中大

沉淀是在洗脱出来形成的，那么在预先收集的管子里先装上偏碱性的缓冲液来中和酸性洗脱液，会有好的效果，可以防止沉淀形成。
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