蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 418  3/42 ‹‹12345678910›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

蒜泥面条[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107979
精华 1
积分 256
帖子 227
信誉分 102
可用分 1866
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
21

发表于 2013-5-8 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
兄台说的在管子中预先加一定比例的中和液然后接收洗脱液后，立刻晃匀，这是标准做法。

但也有特例，在我们遇到的一些沉淀的案例中，洗脱的时候，柱子下出水口就会看到混浊沉淀流出，而不是因为没有中和的原因，当然有时轻微的沉淀，你把收集的管子立刻摇晃，沉淀也会消失。

很多年前，我用一个5ml的proteinA柱子纯化过量血清时，一洗脱，流出来的洗脱液不一会儿就在管道中变白色，当时着实吓了我一跳，呵呵
顶部
BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
22

发表于 2013-5-8 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您指的兔多抗染出来是拿兔血清直接做的WB?

另外对于WB，我想建议的是，如果有抗原蛋白，最好拿抗原蛋白跑胶做阳性对照，其次拿细胞裂解液或者组织裂解液做筛选，如果一种细胞裂解液做了好几次都失败，阳性CONTROL每次都出来，可以考虑换几个细胞株的裂解液试试。

用抗原蛋白做了WB，结果可以出来，曾用买来的蛋白做细胞株的也染出来了，就是量比较低，但用血清就染细胞株裂解液就不行了
这个血清也是请公司做的，可惜不行

我试着纯化一下吧，希望可以大大提高
顶部
orangecake[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77305
精华 0
积分 512
帖子 724
信誉分 100
可用分 4431
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
23

发表于 2013-5-8 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道楼上可否把具体的你们纯化时（包括单抗和多抗的）认为比较理想的PROTOCOL拿出来分享？我想大家可以在你的推荐下进行操作，这样大家纯化后出了问题也可以在这个帖子下进行讨论。这样不就可以有的放矢了吗？
顶部
蒜泥面条[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107979
精华 1
积分 256
帖子 227
信誉分 102
可用分 1866
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
24

发表于 2013-5-8 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 orangecake 于 2013-5-8 15:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不知道楼上可否把具体的你们纯化时（包括单抗和多抗的）认为比较理想的PROTOCOL拿出来分享？我想大家可以在你的推荐下进行操作，这样大家纯化后出了问题也可以在这个帖子下进行讨论。这样不就可以有的放矢了吗？ ...

这个世界上没有万能的protocol，不同的实验材料，不同的仪器设备，不同的人的理解，都有可能在同一份protocol下做出不同的实验结果。针对不同的项目，我们这里也有不同版本的protocol，基于我们实验室的条件和环境。

在这个帖子里，我还是希望以帮助大家分析疑难杂症为主，而不是在这里讲经说道，实在没这个底气和能力。

望斑竹理解。
顶部
lixi559[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73492
精华 0
积分 560
帖子 820
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
25

发表于 2013-5-8 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想从羊多抗中纯化针对一个多肽片段的抗体，用多肽连接NHS-activated FF（GE）柱子，但说明书中没讲柱体积和配体应该按什么比例进行偶联，如果按摩尔数1：1的话，需要量很大，大概要30mg左右,不太可行。想问下有经验的人，应该怎么选择什么浓度？
顶部
蒜泥面条[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107979
精华 1
积分 256
帖子 227
信誉分 102
可用分 1866
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
26

发表于 2013-5-8 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lixi559 于 2013-5-8 15:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想从羊多抗中纯化针对一个多肽片段的抗体，用多肽连接NHS-activated FF（GE）柱子，但说明书中没讲柱体积和配体应该按什么比例进行偶联，如果按摩尔数1：1的话，需要量很大，大概要30mg左右,不太可行。想问下有经验的人，应该怎么选 ...

你想用一个多肽片段去抗原免疫亲和羊血清中的特异性抗体？

多肽一般都是1-2KD，抗体份子是150KD，所以摩尔比是75-150倍

也就是说理论上你要纯化出75mg特异性多抗，只要1mg多肽就够了

呵呵，不过以上都是理论上的，实际真正在应用领域，需要考虑多肽的纯度，多肽的长度，多肽偶联在填料上后的空间位阻，你偶联的化学反应效率，你填料的配基密度，你血清的特异性抗体丰度等等……

我推荐你如果羊血清足够多的化，用10-15mg多肽（纯度>70%）去偶联5ml的活化填料吧。
顶部
abc816[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77362
精华 0
积分 775
帖子 1190
信誉分 100
可用分 6817
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
27

发表于 2013-5-8 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想问一下用GE公司的1mlHis柱纯化抗体，可见有洗脱峰，电泳液跑出目的条带，但是ELISA没有检测活性很弱请问是怎么回事啊？谢谢
顶部
蒜泥面条[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107979
精华 1
积分 256
帖子 227
信誉分 102
可用分 1866
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
28

发表于 2013-5-8 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 abc816 于 2013-5-8 15:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

想问一下用GE公司的1mlHis柱纯化抗体，可见有洗脱峰，电泳液跑出目的条带，但是ELISA没有检测活性很弱请问是怎么回事啊？谢谢

为什么用HIS柱（兰色的镍柱）纯化抗体？
顶部
abc816[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77362
精华 0
积分 775
帖子 1190
信誉分 100
可用分 6817
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
29

发表于 2013-5-8 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-8 15:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


为什么用HIS柱（兰色的镍柱）纯化抗体？

是因为抗体的羧基端有His和c-myc标签，纯化是用His标签，检测是用c-myc标签
顶部
abc816[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77362
精华 0
积分 775
帖子 1190
信誉分 100
可用分 6817
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
30

发表于 2013-5-8 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能没表达清楚，蛋白是原核表达，载体上有His和c-myc标签，故利用His标签来纯化
顶部
 418  3/42 ‹‹12345678910›››|