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标题:【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2013-5-8 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 abc816 于 2013-5-8 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可能没表达清楚，蛋白是原核表达，载体上有His和c-myc标签，故利用His标签来纯化

你抗原蛋白上有6HIS标签是不错，但是你抗体上不会有6HIS标签啊
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abc816[使用道具]
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 小中大


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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-8 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


你抗原蛋白上有6HIS标签是不错，但是你抗体上不会有6HIS标签啊

我的抗体就是原核表达的重组蛋白，是一个单链抗体
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 小中大


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原帖由 abc816 于 2013-5-8 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我的抗体就是原核表达的重组蛋白，是一个单链抗体

哦，我以为你抗原是HIS融合蛋白，抗体是天然表达的完整抗体。

原来你表达的是单链抗体.

你说你的洗脱产物没有活性，那你原液流穿有没有同一块板子测过活？

测的是C-MYC？
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-5-8 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

测的是c-myc，原液有，流出液也有但较弱，不知道是不是洗脱的时候蛋白变性了
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发表于 2013-5-8 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那有可能你这个单链抗体在纯化的过程中失活

最好你把电泳结果和ELISA结果都放上来，那样看的更全面

现在做单链抗体的不多了，就是因为单链抗体不稳定，相对比较容易失活
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发表于 2013-5-8 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
抗原免疫亲和纯化怎么做？我想纯化多肽抗体。到Pubmed上找相关文献，不知道用什么关键词，没找到。您手上有这方面的文献吗？
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发表于 2013-5-8 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 eric930 于 2013-5-8 15:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
抗原免疫亲和纯化怎么做？我想纯化多肽抗体。到Pubmed上找相关文献，不知道用什么关键词，没找到。您手上有这方面的文献吗？

mmunoaffinity purification

主要分 抗原的偶联，亲和柱制备，血清的处理，纯化和鉴定这几个大步骤

没有固定的万金油protocol的
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发表于 2013-5-8 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

单链抗体亲和力是很弱的
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sunshine039[使用道具]
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发表于 2013-5-8 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是基因重组的，会更弱
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remenb[使用道具]
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发表于 2013-5-8 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你想用一个多肽片段去抗原免疫亲和羊血清中的特异性抗体？

多肽一般都是1-2KD，抗体份子是150KD，所以摩尔比是75-150倍

也就是说理论上你要纯化出75mg特异性多抗，只要1mg多肽就够了

呵呵，不过以上都是理论上的，实际真正在应用领域，需要考虑多肽的纯度，多肽的长度，多肽偶联在填料上后的空间位阻，你偶联的化学反应效率，你填料的配基密度，你血清的特异性抗体丰度等等……

我推荐你如果羊血清足够多的化，用10-15mg多肽（纯度>70%）去偶联5ml的活化填料吧。

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谢谢指导，我用2mg的多肽连到1ml柱子上，纯化15-20ml的羊血清（针对该多肽的效价为10^4，预先经protein A纯化过），结果不好，不仅纯化后的抗体不纯，漏过液中还有未结合的针对该多肽的抗体，不知道什么原因？是柱子连接的问题，还是纯化过程的问题？
那个偶联多肽的时候，由于说明书上要求用高浓度的Na盐做偶联buffer,我的多肽在里面不溶，就用的水溶解的，不知道是不是这个原因啊？？？
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