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标题:【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

蒜泥面条[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 remenb 于 2013-5-8 15:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你想用一个多肽片段去抗原免疫亲和羊血清中的特异性抗体?

多肽一般都是1-2KD,抗体份子是150KD,所以摩尔比是75-150倍

也就是说理论上你要纯化出75mg特异性多抗,只要1mg多肽就够了

呵呵,不过以上都是理论上的,实际真正在 ...

你说的10E4是什么概念? ELISA测的?多少稀释度下,OD读数是多少,最好用这个来表示

比如你告诉我OD值大于0.3的时候,你的血清样品稀释了多少倍,这样我才好判断你的血清效价

抗体不纯,最好能提供SDS-PAGE结果照片

流穿里还有阳性抗体残留,这个都有可能

偶联的原因也有
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remenb[使用道具]
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血清稀释1:10^4的时候OD值0.29,抗体不纯是说纯化后的抗体不仅能和我纯化的多肽片段反应,还有和其他片段反应的抗体,效价比目的片段低一个数量级,10^3左右
不知道应该怎么鉴定柱子偶联的是不是成功呢
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1:10000稀释度,OD等于0.29,这样的滴度以我们的标准来衡量是中低,不过也不算最差

抗体的特异性不好,这个可能跟你抗原设计有关,抗原的序列本身同源性高,就容易交叉
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flower-201[使用道具]
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请教几个问题:
关于嗜硫,proteinA和proteinG不是太明白他们的区别:
1.嗜硫(Thiophilic Resin)和 protein A resin的区别:
在clontech公司网站上这样介绍嗜硫树脂:
Both Thiophilic-Uniflow and -Superflow Resins utilize thiophilic adsorption chromatography. With this technique, protein adsorbs to a sulfone thioether ligand. The adsorption of different proteins can be promoted by adding different salts to the mixture. Varying the concentration of the loading salt can affect the adsorption affinities of IgG, IgM, IgA, Fab and Fc fragments, and C3 and C4 complement factors (1).

Purification with Thiophilic Resins offers several advantages over purification with Protein A, the conventional method used for immunoglobulin purification:

Purification at neutral pH
High linear flow rates
High capacity (15–20 mg Ab/ml resin)
Broader selectivity (IgY, IgM, IgE, scAb)
Reusability
Higher stability of the purified product
好像嗜硫树脂的优点非常多,但是在实际应用中,好像大部分人还是倾向于protein A resin。我没有实际应用过这两种树脂,想问一下实际应用中这两种树脂的差别?

2.proteinA和proteinG的区别:
我知道在免疫沉淀实验时候同时用proteinA和proteinG效果会比较好,但是他们的区别是什么呢?何时用proteinA比较好,何时用proteinG比较好呢?

3.据我了解,proteinA有普通蛋白的也有重组蛋白的,重组蛋白会删掉一些非特异结合区域。想问一下在实际应用中你们用那种比较多?如果我想开发商品化的proteinA resin,从使用者角度对我有什么建议?

不好意思一下问了这么多问题,有的可能比较初级。
先谢谢了!
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QUOTE:
原帖由 flower-201 于 2013-5-8 15:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教几个问题:
关于嗜硫,proteinA和proteinG不是太明白他们的区别:
1.嗜硫(Thiophilic Resin)和 protein A resin的区别:
在clontech公司网站上这样介绍嗜硫树脂:
Both Thiophilic-Uniflow and -Superflow Resins utilize  ...

嗜硫不是一种特异性亲和,是疏水+亲硫
所以特异性不如proteinA好,还有吸附力也是proteinA强

先回答你proteinA和rProteinA的区别

天然的proteinA是提取自金黄色葡萄球菌表面的膜蛋白,重组的proteinA则是大肠杆菌重组表达的。

重组的优点是通过基因工程改造,使得FC片段的结合区域增多,另外更好的rProteinA在改造的时候在proteinA的原有序列上,在特定的位置编入一个Cystein,使得在和环氧填料结合时,能特异性的定向偶联。这样做也是为了提高载量。

proteinG其实现在已经没什么优点了,以前早起的proteinA载量低,亲和力弱,所以用proteinG亲和力强和对IgG亚型广谱的优点。

但是现在rProteinA已经可以替代proteinG
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但是现在rProteinA已经可以替代proteinG

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对单抗IgG,基本上绝大部分都可以替代。
但是对多抗血清,很多时候还是不能替代的。例如,羊多抗血清(goat)。
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看了大家的讨论,受益很多!
Protein A和protein G还是不能完全替代。某些种属的抗体如rabbit,还是需要protein G。
对于生物制药,一般为人抗体(多为IgG,当然也有IgM等),除human IgG3外,都可以用protein A,所以,protein A的填料发展近年较迅猛些。

无论是research还是生产,填料的清洗和寿命是非常关键的,尤其是近年SFDA对清洗验证的要求,所以能否耐碱是非常关键的。SuRe填料无疑是最佳,去年,Genentech也已经将生产用protein A升级到SuRe,是新填料技术降低了药企的生产成本。


[ 本帖最后由 ukonptp 于 2013-5-8 15:48 编辑 ]
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QUOTE:
原帖由 ukonptp 于 2013-5-8 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看了大家的讨论,受益很多!
Protein A和protein G还是不能完全替代。某些种属的抗体如rabbit,还是需要protein G。
对于生物制药,一般为人抗体(多为IgG,当然也有IgM等),除human IgG3外,都可以用protein A,所以,protein A的填 ...

从我纯化的无数兔单抗和多抗的经验来看,对于rabbit IgG,mabselect SuRe(rproteinA)完全可以取代proteinG

我们还用SuRe纯化过小鼠的腹水,效果也比proteinG好
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ukonptp[使用道具]
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很多时候我们会发现,即使种属和亚型一样,亲和结合和洗脱的条件可能也会大相径庭,再比如很多时候低pH洗脱的方式就是不合适的。
作为生物药物的重磅炸弹,治疗用单抗上下游工艺要考虑的问题可能会稍多一些。
多抗和单抗还是会有一定的差别,另外兔单抗在很多方面优于鼠抗,laboy这方面能否可以多分享一些?
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很多时候我们会发现,即使种属和亚型一样,亲和结合和洗脱的条件可能也会大相径庭,再比如很多时候低pH洗脱的方式就是不合适的。
作为生物药物的重磅炸弹,治疗用单抗上下游工艺要考虑的问题可能会稍多一些。
多抗和单抗还是会有一定的差别,另外兔单抗在很多方面优于鼠抗,laboy这方面能否可以多分享一些?

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兔单抗和鼠单抗各有优缺点吧
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