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标题:【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

ha111[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
他这个案例中，用细菌来表达无热源重组蛋白，本身就不是最佳的路线。

要除干净，达到药典的标准，要花很大的力气，除非运气特别好，摸索到一个很好的条件，样品损失也不多，内毒素还能达标

==============================================================================================================

确实，要有好运气。
和目标蛋白的性质关系非常大。

不过在我有限的重组蛋白药物纯化工艺开发过程中，倒是成功地开发了两个这样的产品，碱性蛋白，方便地去除了内毒素，符合药品申报QC检测，呵呵。
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蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ha111 于 2013-5-8 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
他这个案例中，用细菌来表达无热源重组蛋白，本身就不是最佳的路线。

要除干净，达到药典的标准，要花很大的力气，除非运气特别好，摸索到一个很好的条件，样品损失也不多，内毒素还能达标

====================================== ...

你太谦虚了

细菌表达的产品能做到内毒素达标那已经很了不起了,你还做成功过2个，牛！

不过现在真核体系也蛮多的，如果用量不是很大的蛋白产品，可以考虑用真核，这样后期会方便很多
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发表于 2013-5-8 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目前已经上市的很多生物药物都是细菌表达，甚至包括剂量较大的治疗用plasmid。
难度主要在于宿主本身细胞壁是大量内毒素的直接来源。
最终产品能否达到药典要求，更重要的是看药物的使用剂量，如果剂量只有ug级，那并不困难，如果不考虑蛋白的翻译后修饰引起的比活问题，仅考虑内毒素的话，动物细胞由于本身培养条件和成本的苛刻并没有优势；如果剂量达到上百毫克蛋白，原核是非常困难的。
规模现在并不是问题，即使国内也已经有上千升的动物细胞反应器成功地运转，国外据我所知，动物细胞培养的抗体滴度可以达到27g/L发酵液以上，比起原核也并不逊色多少。
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发表于 2013-5-8 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2013-5-8 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

目前已经上市的很多生物药物都是细菌表达，甚至包括剂量较大的治疗用plasmid。
难度主要在于宿主本身细胞壁是大量内毒素的直接来源。
最终产品能否达到药典要求，更重要的是看药物的使用剂量，如果剂量只有ug级，那并不困难 ...

国内真核表达抗体
能做到1-5g/L就已经很不错了
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发表于 2013-5-8 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
国内真核表达抗体
能做到1-5g/L就已经很不错了

我刚刚纯化了一批抗体，2.9升的腹水生产了3.7克的抗体，看来要达到27g/L还有很长的路要走啊。
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am10[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们打了500只老鼠，纯化了近半个月，挺费力的一件事，纯化过程中也遇到一些问题，比如用Tris-Hcl PH9.0回调PH值时有少量沉淀产生，后来通过离心除去，但毕竟还是损失了一些。因为洗脱的量很大，我们回调PH值时并不是事先在离心管里加好tris ，而是全部洗下来后再用Tris回调的，请问 laboy 兄，有没有好的办法解决回调PH值时产生的沉淀问题，谢谢了。
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发表于 2013-5-8 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 am10 于 2013-5-8 16:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们打了500只老鼠，纯化了近半个月，挺费力的一件事，纯化过程中也遇到一些问题，比如用Tris-Hcl PH9.0回调PH值时有少量沉淀产生，后来通过离心除去，但毕竟还是损失了一些。因为洗脱的量很大，我们回调PH值时并不是事先在离心管 ...

哇，真是那么多腹水啊，太残忍了
你们打肿瘤恐怕都倒到手抽筋吧

抗体沉淀前面也讨论到过
如果你的洗脱液缓冲体系没问题的话
一个是预先滴加中和液
另一个是控制洗脱的速度和浓度

另外可以在洗脱液中添加一些保护剂什么，比如低浓度甘油，如果对你的后续没影响。
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ha111[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚刚纯化了一批抗体，2.9升的腹水生产了3.7克的抗体，

===================================================================

2.9L腹水只纯化了3.7g抗体太少了。不知道你是腹水制备的有问题，还是纯化得有问题。
2.9L腹水应该得到10-15g左右抗体正常。
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ha111[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们打了500只老鼠，纯化了近半个月，挺费力的一件事。

=====================================================

为什么要纯化这么长时间？这个规模我们也常做，应该不超过5天。
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蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个规模我们也常做，应该不超过5天。

==============================================

你们这些刽子手！！

我一般从来不自己动手杀生，何况是那么大规模的杀生
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