【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖 - 经验共享

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标题:【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2.9L腹水只纯化了3.7g抗体太少了。不知道你是腹水制备的有问题，还是纯化得有问题。
2.9L腹水应该得到10-15g左右抗体正常。

为什么要纯化这么长时间？这个规模我们也常做，应该不超过5天。

==============================================================================================================

我们的产量确实偏低了些，纯化方面有些问题，离心时看见那些沉淀都心疼，最近一次纯化我们改进了一些，降低了洗脱浓度，增加了稀释倍数，沉淀的问题得到了一些改善，3L的腹水得到了7g的抗体，虽然还没有能达到如您所说的10-15g，但毕竟有了一些提高。我的穿透液里还有些未结合部分，所以再上一次柱应该还能回收一点。下一步我们会解决一下挂柱效率的问题，进一步减少损失。

我们用的层析柱是10ml的，一次纯化使用8个柱子，所以上样量有限，另外我们是一边收腹水一边纯化，所以感觉战线拉的长了点，呵呵。

66+77[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问表达在包涵体的带his标签的蛋白，怎么样过柱纯化效果最好？如果在尿素中不能挂柱，要用什么表面活性剂去处理？采用什么处理方法呢？谢谢！

蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 66+77 于 2013-5-8 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问表达在包涵体的带his标签的蛋白，怎么样过柱纯化效果最好？如果在尿素中不能挂柱，要用什么表面活性剂去处理？采用什么处理方法呢？谢谢！

我就凭我仅有的经验越俎代庖一下

不挂柱有3个方法去解决：

1，样品变性要充分，如果8M尿素不行，就换6M盐酸胍，还可以加点低浓度2-ME打开2硫建
2，用IDA介质的NI填料，不用NTA，IDA载量更高，所以对HIS的吸附力会更强一些，同时降低上洋流速
3，N-/C-两端加6HIS 防止出现单侧6HIS被肽链特殊结构给遮盖

希望对你有帮助，祝顺利

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发表于 2013-5-8 16:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-8 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我就凭我仅有的经验越俎代庖一下

不挂柱有3个方法去解决：

1，样品变性要充分，如果8M尿素不行，就换6M盐酸胍，还可以加点低浓度2-ME打开2硫建
2，用IDA介质的NI填料，不用NTA，IDA载量更高，所以对HIS的吸附力会更强一些，同时降低 ...

你说的对我都很有用。
目前我尝试了变性纯化，效果不是很理想，所以我希望能用表面活性剂处理。

H2O[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在刚进实验室老板让我纯化抗体IgG（从细胞培养液中纯化），现在关于proteinA/G的有很多种哦，我不知买那一种比较好，希望得到各位的指点。谢谢啦~~
现在看到的介质有:HITRAP PROTEIN A/G HP, HITRAP RPROTEIN A FF,PROTEIN A SEPHAROSE CL-4B, RPROEIN A/G SEPHAROSE FF, NPROTEIN A SEPHAROSE 4 FF

PS:问个比较弱智的问题哦，FF，HP 是什么意思啊？

蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

FF Fast Flow 高流速
HP High Performance 高载量或者高性能

不知道你要纯化多少抗体，如果要经常用，重复使用，那建议买GE公司Mabselect SuRe，不过这个包装有点大

另外可以买Hitrap rProteinA的散装和预装都可以，如果是一般用用，国产有些proteinA填料也可以，GE的就是价格贵。

没什么特殊需要，不需要买nProteinA

fox_79[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在正在处理Sephadex G-50干粉，准备装柱哦，我是先泡24小时然后用0.1M的NAOH泡一小时然后用蒸馏水洗到中性哦（用布氏漏斗抽滤），不过装柱时发现飘起来很多泡泡哦不容易沉降。。我想请教楼主填料怎么处理啊？谢谢。

蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

会浮起来，可能是因为颗粒内部有气体

你可以煮一下

fox_79[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

煮完之后让它自然冷却再装？还是煮完之后用NAOH处理下再装啊？

蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2013-5-8 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 fox_79 于 2013-5-8 16:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

煮完之后让它自然冷却再装？还是煮完之后用NAOH处理下再装啊？

如果是新的填料，不一定需要NAOH处理

煮完，自然冷却就行

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