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标题:【求助】Western blot实验加入发光底物后未见光...

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发表于 2013-5-11 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能是你用的一抗是回收抗体，效价不行了，

也有可能是你的蛋白降解了，你转完膜以后用丽春红染过膜没有？看你的蛋白是不是转膜成功？

============================================================

转膜没问题，用丽春红染过，转膜效果很好。今天重新配一抗孵育，明天看看结果。
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发表于 2013-5-11 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天重新加大一抗浓度孵育了，今天曝光结果还是白板，天理何在呀？！！
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发表于 2013-5-11 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议还是再检查下二抗吧，白板的话多半还是抗体的问题
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发表于 2013-5-11 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
总结下，几种情况：

一抗的问题，不建议回收使用，如果连续做可以。

蛋白丰度太低，如果目标蛋白是非磷酸化蛋白也比较好做，建议改用Dura显色试试，提高检测灵敏度。

检测TBST的PH值，过高会导致曝光出白板。

祝你好运！
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发表于 2013-5-11 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议还是再检查下二抗吧，白板的话多半还是抗体的问题

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二抗没问题的，稀释后的二抗与ECl工作液能立即发光，做了一抗二抗点杂交也没有问题的。
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发表于 2013-5-11 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
总结下，几种情况：

一抗的问题，不建议回收使用，如果连续做可以。

蛋白丰度太低，如果目标蛋白是非磷酸化蛋白也比较好做，建议改用Dura显色试试，提高检测灵敏度。

检测TBST的PH值，过高会导致曝光出白板。

祝你好运！

=======================================================================================================

一直怀疑是TBST的ph值问题，我测得的我的TBST是酸性的，之前有听说过这个会曝出白板，不知道是不是。给调了PH值重新做了，等结果。
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发表于 2013-5-11 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酸性不会影响很大，要是碱性偏大的话很大程度上会是白板的，再试试吧。
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发表于 2013-5-11 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
TBST的ph值调了，重做，仍然白板，连可曝光的Marker也没出 ，何故？究竟何故？？？
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jkobn[使用道具]
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发表于 2013-5-11 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你试试降低一抗的稀释比（从1:1K降到1:500到1:250到。。。），摸索到一个可以标出信号的条件。此时，由于一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景的问题可以再调整，有没有特异性条带却没办法改变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换别的公司生产的抗体。

顺便问下，你做的是什么目标蛋白？
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flower@@[使用道具]
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发表于 2013-5-11 11:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jkobn 于 2013-5-11 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你试试降低一抗的稀释比（从1:1K降到1:500到1:250到。。。），摸索到一个可以标出信号的条件。此时，由于一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景的问题可以再调整，有没有特异性条带却没办法改变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换别的公 ...


做的是线粒体中的一个蛋白，MT-CO1，买的abcam公司的，推荐稀释比为1:2000,之前预实验1:2000出过，后来正式试验1:1000也做出来过挺好。但最近就一直不出了。而且曝光的片子都是白板，连背景都没有。
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