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标题:【求助】Western blot实验加入发光底物后未见光...

u234[使用道具]
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你的skim-milk里面有没有加其他成分?
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flower@@[使用道具]
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老问题又来了!好久没有出白板了,今天做又出白板了。条件没有变,可以什么都没有做出。打电话给抗体技术支持,解答得比较官方。说可能是封闭或者抗体浓度不够,但问题是我同意的条件做出来过呀。蛋白转膜我相信都是没有问题的,有些怀疑蛋白一抗二抗之间的结合问题,但非常不明白,为什么同意的条件,有时候有有时候没有。没有的时候白板,背景都没有。我想是不是还有哪些操作细节没有注意到忽略了,还是有其他原因?课题时间紧张,拜求高人指点!
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rxcc33[使用道具]
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技术问题,有专人带下最好。 既然是白板,就有必要把一抗二抗浓度提升一倍试试看吧。
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mamamiya[使用道具]
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我也遇到和楼主相同的问题,但是相同的条件,仪器,液体,一抗,二抗。。。别人都能跑出来,我一个月前也能跑出来,但是现在好多次都是白板。。。求解的啊~~~~~
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flower@@[使用道具]
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技术问题,有专人带下最好。 既然是白板,就有必要把一抗二抗浓度提升一倍试试看吧。

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这个蛋白我做出来过,同样的条件。以前也出过白板,调一抗不起作用,一旦出了白板,这张膜striping后再做内参或者任何其他蛋白也不会出,都是白板。
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flower@@[使用道具]
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我也遇到和楼主相同的问题,但是相同的条件,仪器,液体,一抗,二抗。。。别人都能跑出来,我一个月前也能跑出来,但是现在好多次都是白板。。。求解的啊~~~~~

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同一个问题,我想各自答案可能不一样,一方面高人求解,一方面自己分析找原因吧,毕竟自己的实验操作步骤自己最了解,加油!
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zwsyrt[使用道具]
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这个蛋白我做出来过,同样的条件。以前也出过白板,调一抗不起作用,一旦出了白板,这张膜striping后再做内参或者任何其他蛋白也不会出,都是白板。

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一般来讲,白板的原因很多,但其中最可能的原因有下面几个,依次为:
1,二抗浓度不够
2,一抗浓度不够
3,转膜出了问题
4,ECL出了问题

你也说了,自己的实验自己清楚,你自己去排查吧。
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junhun[使用道具]
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按照Lz的说法,结合我们这边的经验分析,认为应该是转膜的问题的。38kd的目的蛋白,为什么要120v转1h。很是不明白LZ是根据什么条件选择的这样的转膜条件。
跟大家分享下,我们的做法。半干转的话,1KD转1min,以此类推,15v。湿转的话。12v过夜。
另外,没有条带的原因还有蛋白样品存放时间过长或者反复冻融次数过多造成蛋白降解、上样量太少,蛋白量低于检测抗体的检测低限、洗涤时间过长、抗体效价过低和加入显色底物和观察曝光结果的间接时间过长等等,都会造成无条带的现象。
以上仅供LZ参考。
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flower@@[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 junhun 于 2013-5-11 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
按照Lz的说法,结合我们这边的经验分析,认为应该是转膜的问题的。38kd的目的蛋白,为什么要120v转1h。很是不明白LZ是根据什么条件选择的这样的转膜条件。
跟大家分享下,我们的做法。半干转的话,1KD转1min,以此类推,15v。湿转 ...

感谢分析,最近也在怀疑转膜的问题。我们是湿转,过夜转没有试过,兄台的意思任何分子量的湿转都是可以12V过夜是吗?
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101010[使用道具]
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感谢分析,最近也在怀疑转膜的问题。我们是湿转,过夜转没有试过,兄台的意思任何分子量的湿转都是可以12V过夜是吗?

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我们这这边现在大部分都是湿转。另外,就是要根据你的蛋白大小选择膜的孔径。
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