【求助】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统...

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统...

95 1/10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统...

ffaa[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72870
精华 0
积分 416
帖子 511
信誉分 100
可用分 3396
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-5-11 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
感染
不知道有多少人成功用杆状病毒——昆虫细胞表达系统成功进行过蛋白表达？我最近表达一段病毒的非结构蛋白nsp-6，构建的重组Bacmid质粒经PCR鉴定正确，可是进行表达时，却未见蛋白表达，同时进行的试剂盒对照（含CAT基因的重组细胞中则有较好的表达。
我听说约有70%的蛋白在原核表达系统中是不表达的，但不知道这样的情况会不会发生在我用的昆虫细胞表达系统，除了实验操作失误方面的原因，还有什么因素是不使蛋白表达的，请大家讨论一下。

下面是我的实验过程，请高手指教，同时希望也给新手一个指导吧（我使用的是Invitrogen的产品，具体说明书大家可以参照Invitogen操作手册cuturl('http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf')）：

The genes of nsp-6 was cloned into BamHI and EcoRI sites of the pFastBac HTA vector, then the ligation reaction was transformed into DH10B and selected for ampicillin-resistant transformants (LB plates, ampicillin 100μg/ml); The constructed pFastBac vector was transformed into DH10Bac E.coli for transposition into the bacmid,  blue/white selection was used to identify colonies containing the recombinant bacmid and the bacmid was also analyzed by PCR with the M13 primers. Once the recombinant bacmid was confirmed, it was ready to transfect insect cells.
Sf9 were maintained in TNH-SFM complete medium。
抱歉该段未翻译成中文。

实验材料：
1.  重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2.  昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自 Roche。
实验步骤：
一、  昆虫细胞转染：
1．  Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．  准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a.  溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b.  转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c.  将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．  重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．  取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．  移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、  病毒贮液的制备：
1.  病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2.  上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
3.  病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：

感染所需病毒贮液量(ml)=
[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]
注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。

4.  扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：
a.  转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
b.  每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。
c.  根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
d.  制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。

三、  病毒贮液初步鉴定
1.  SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。 CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。
2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。
3.  以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA试剂和说明书。

结果
1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细胞中。
2. 蛋白电泳和免疫印迹均看见对照his-CAT蛋白表达，但不见我想表达的非结构蛋白his-nsp-6。

在接下来的这段时间里，一直在进行条件的摸索，现在把这段时间的结果报告一下：
1. 利用细胞DNA提取试剂盒提取感染细胞的DNA，用针对目的基因的特异性引物以PCR的方法鉴定，发现结果呈阳性，表明该质粒成功转染，但为何不表达，仍需摸索。
2.根据上述结果，在后续的实验当中发现用感染的细胞涂片，使用特异性针对目的蛋白的抗体做免疫荧光鉴定，发现呈阳性，这一点证实转染的质粒成功且有蛋白表达，问题是为什么表达量如此低，以至于免疫印迹检测不出来？

下一步将要进行的工作是，摸索如何提高蛋白表达量的方法，使用空斑纯化获得较纯的病毒不知道能不能提高蛋白表达量？这一点，也请有经验的站友给与指导，谢谢！

remenb[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75236
精华 0
积分 631
帖子 941
信誉分 100
可用分 5531
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2013-5-11 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的实验过程我没有发现问题，具体原因真的难说。在BEVS系统中，Bac-to-Bac不是最有效的,我觉得没必要选择穿梭，效率低。你可以用pBacPAK或者诸如此类的载体，直接用线性化野生病毒去转染。
你的实验过程绝对没问题，重组Bacmid你也鉴定了，那说明转座没有问题。而后的共转染也没问题，因为你的sf细胞看到了明显的病变，多角体也出现了。最好，你把p1和p2的病毒上清液以100 000 g超速离心30min并取其沉淀，用TE缓冲液悬浮后经蛋白酶K 37 ℃消化2 h，再经酚、酚-氯仿、氯仿抽提后用乙醇沉淀浓缩，以其为模板进行PCR鉴定。这样就可以完全放心，排除这之前的问题。
如果鉴定正确，你就只从SDS-PAGE排除问题就可以了。是不是低表达的缘故？我觉得你SDS-PAGE技术肯定没有问题，因为你对照已经出来了。你可以增加sample量看看。最好一个个排除，试验就是这样，别急。
如果有什么其它问题，我们可以在这里讨论。祝顺利，早日得到结果。

ffaa[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72870
精华 0
积分 416
帖子 511
信誉分 100
可用分 3396
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-5-11 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顺便问一下P1或P2液取多少进行DNA抽提，方便的话，能不能将抽提具体方法在这里贴出来，让我和其它站友多一个学习的机会。

remenb[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75236
精华 0
积分 631
帖子 941
信誉分 100
可用分 5531
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2013-5-11 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我不知道你病毒的滴度，至于体积我想不成问题。你可以多制备点，反正是病毒繁殖，3天肯定发病，一般10毫升就行了。8000rpm离心10min，上清液用sw-27转子（Bechman）24000rpm超离30min，将沉淀的病毒粒子悬于1ml TE中，加蛋白酶K至终浓度50微克/微升，50度水浴2小时，再加Sarkosel至终浓度1%(根据本人经验，没有就可以不加），50度水浴2小时；用等体积饱和酚，氯仿/异戊醇各抽提一次，12000rpm离心5min,上清液加入2.5倍95%冷乙醇，DNA沉淀后，3000rpm离心10min,70%乙醇洗，溶于0.1乘TE中，电泳检查，4度放置。

dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态离线

发表于 2013-5-11 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我正在用Invitrogen公司Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System表达目的蛋白,构建好穿梭质粒pBACmid后,在转染入昆虫细胞sf21时碰到极大困难,经多次试验仍然无法成功转染.所用转染试剂CELLFECTIN、细胞sf21、需血清培养基Grace’s Insect Cell Culture Medium（PAA公司"GOLD" defined Foetal Bovine ）、无血清培养基Sf-900 II SFM都为Invitrogen公司新购产品（FBS除外，为PAA公司）。
转染完全按照公司所推荐方案进行：
1. In a 6-well or 35 mm tissue culture plate, seed 9 00000 Sf9 cells per well in 2 ml of growth medium containing antibiotics (e.g. 2 ml of Sf-900 II SFM containing 50 units/ml penicillin and 50 µg/ml streptomycin final concentration).
2. Allow cells to attach at 27°C for at least 1 hour.
3. For each transfection sample, prepare bacmid DNA:Cellfectin® Reagent complexes as follows in 12 x 75 mm sterile tubes.
a. Dilute 1 µg of purified bacmid DNA in 100 µl of unsupplemented Grace’s Medium. b. Mix Cellfectin® Reagent thoroughly before use by inverting the tube 5-10 times. Remove 6 µl of Cellfectin® Reagent and dilute in 100 µl of unsupplemented Grace’s Medium.
c. Combine the diluted bacmid DNA with the diluted Cellfectin® Reagent (total volume
is ~210 µl). Mix gently and incubate for 15 to 45 minutes at room temperature.
4. While DNA:lipid complexes are incubating, remove the media from the cells and wash once with 2 ml of unsupplemented Grace’s Medium. Remove the wash media.
5. Add 0.8 ml of unsupplemented Grace’s Medium to each tube containing the DNA:lipid complexes. Mix gently and add the DNA:lipid complexes to each well containing cells.
6. Incubate the cells in a 27°C incubator for 5 hours.
7. Remove the DNA:lipid complexes and add 2 ml of complete growth media (e.g. Sf-900 II SFM containing antibiotics) to the cells.
8. Incubate the cells in a 27°C humidified incubator for 72 hours or until you start to see signs of viral infection.
穿梭质粒pBACmid的提取起先是用Invitrogen公司推荐的手工方法，后来是用Promega公司Wizard® PlusMinipreps DNA Purification System；昆虫细胞的培养是用含10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，转染时换为无血清培养基Sf-900 II SFM（不含抗生素或其它添加剂）。所有试验都无法成功转染，故特来请教，望不吝赐教。

sunshine039[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74211
精华 0
积分 253
帖子 205
信誉分 100
可用分 1821
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态离线

发表于 2013-5-11 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您的操作过程若是完全按照上述protocol进行，应该是不会有问题的。穿梭质粒的提取我们目前也是用Invitrogen公司推荐的手工方法，结果很好，没出现什么问题。

问题应该发生在以下这一步：

==========================================================================================================

昆虫细胞的培养是用含10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，转染时换为无血清培养基Sf-900 II SFM（不含抗生素或其它添加剂）。

===========================================================================================================

参考：
1. 10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium是否含有L-谷氨酰胺，状态如何（要求细胞存活率应达到97%，才能达到较好的转染效果），首先排除转染前的细胞问题。
2. 另外就是转染后你更换了培养基（从Grace’s Insect Cell Culture Medium到Sf-900 II SFM），我觉得问题最有可能出现在这一步，昆虫细胞一直是在10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium中培养，可转染后突然换成无血清培养基Sf-900 II SFM，对细胞生长是不利的。不知道你加入Sf-900 II SFM培养后的细胞状态如何。此处建议转染后仍然使用10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium培养，扩增P1、P2、P3病毒贮液，正式表达蛋白之前按照Invitrogen公司推荐的方法，让细胞先适应无血清的环境，方可进行大量感染及表达。

BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态离线

发表于 2013-5-11 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 关于L-谷氨酰胺,所购Grace’s Insect Cell Culture Medium(powder)中是含有的,贮藏过程中及配成溶液后在-20度和接下来的4度存放到底有无分解就不清楚了,但昆虫细胞的生长状态良好,这方面的问题应该不大.
2.有一点我描述有误，虽然转染时我改用无FBS、无抗生素的Sf-900 II SFM，但转染后我又换回10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，之后细胞没有出现病毒感染迹象，细胞不停在生长。

接下来我想对试验方案做以下改变:
1.用promega公司Wizard® PlusMiniprepsDNA Purification System多提取pBACmid用以转染,因为所需DNA量是专指pBACmid,DH10BAC中的质粒除pBACmid外还有helper plasmid,pBACmid只占一部分。
2.转染前一天接种细胞，但涉及到用何种培养基的问题，即接种后至转染这段时间是用不完全培养基还是完全培养基（转染前再用不完全培养基洗）。
3、转染时不用Sf-900 II SFM 而改用不完全Grace’s Insect Cell Culture Medium（不含FBS和抗生素，但含lactoalbumin 和yeastolate）。
不知以上考虑是否符合实际？

jujuba[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79697
精华 0
积分 612
帖子 903
信誉分 100
可用分 5331
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态离线

发表于 2013-5-11 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外,我用Invitrogen公司推荐的手工方法提取的穿梭质粒常混有RNA，我认为是操作方案中RNAaseA的作用温度为室温引起的,因为其它提取方法是在55度反应10分钟.而且该方案提取的质粒成分复杂，给穿梭质粒的定量也带来问题，你所说的穿梭质粒的量是如何精确度量的？

wood533[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2013-5-11 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我感觉remenb的说法是有道理的。Bac-to-Bac系统不是最有效的,往往表达的效率不高，我所在的实验室的师兄表达蛋白占4—5％左右；而我用的是用线性化野生病毒，载体是pMelBac，转染表达是近20％，目前我所在实验室都已经用此载体了。不妨试一下。另外，在表达物基因和表达系统间似乎还有某种相关性的联系，我也想请教各位前辈。谢谢！

ffaa[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72870
精华 0
积分 416
帖子 511
信誉分 100
可用分 3396
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-5-11 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

关于L-谷氨酰胺,所购Grace’s Insect Cell Culture Medium(powder)中是含有的,贮藏过程中及配成溶液后在-20度和接下来的4度存放到底有无分解就不清楚了,但昆虫细胞的生长状态良好,这方面的问题应该不大.

===========================================================================================================

一般L-谷氨酰胺在培养基中，4度可以稳定存在一个月左右，超过时间最好补加。另外不推荐将该培养基冻存于-20度，最好现配现用。但是既然你的细胞状态不错，那么应该不是培养基的原因。

95 1/10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ››