蛋白质与蛋白组学

有一点我描述有误，虽然转染时我改用无FBS、无抗生素的Sf-900 II SFM，但转染后我又换回10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，之后细胞没有出现病毒感染迹象，细胞不停在生长。

===============================

和正常细胞比较，72h后，没有任何变化？

接下来我想对试验方案做以下改变:
1.用promega公司Wizard® PlusMiniprepsDNA Purification System多提取pBACmid用以转染,因为所需DNA量是专指pBACmid,DH10BAC中的质粒除pBACmid外还有helper plasmid,pBACmid只占一部分。

===========================================================================================================

我也觉得用试剂盒提取会更好，只不过目前我们没有购买专门的提取试剂盒。但是我觉得这里的helper plasmid不会有太大影响，否则invitrogen 的protocol上也不会说可以用手工法提取了。而且我们就是用手工提取法做的，效果不错，就是不知道会不会对下一步蛋白表达的量有影响（这个问题还需进一步探讨）。

2.转染前一天接种细胞，但涉及到用何种培养基的问题，即接种后至转染这段时间是用不完全培养基还是完全培养基（转染前再用不完全培养基洗）。

===========================================================================================================

我不建议提前一天接种细胞，因为细胞会进行增殖，这样转染的量可能会不准。至于培养基，我还是觉得用完全培养基好，这样可以保证转染前的细胞状态是最佳的。而且我们这样做，效果也是很明显的。

3、转染时不用Sf-900 II SFM 而改用不完全Grace’s Insect Cell Culture Medium（不含FBS和抗生素，但含lactoalbumin 和yeastolate）。
不知以上考虑是否符合实际？

===========================================================================================================

我们转染一直使用的是Grace’s Insect Cell Culture Medium, unsupplemented(Cat No.11595-030)，效果不错，而且我建议你不要使用抗生素，只要操作注意，不会造成污染，这样也不会让抗生素对转染造成可能的影响。

另外,我用Invitrogen公司推荐的手工方法提取的穿梭质粒常混有RNA，我认为是操作方案中RNAaseA的作用温度为室温引起的,因为其它提取方法是在55度反应10分钟.而且该方案提取的质粒成分复杂，给穿梭质粒的定量也带来问题，你所说的穿梭质粒的量是如何精确度量的？

===========================================================================================================

我们通常采用紫外分光光度计对其定量。个人经验是：由于Bacmid比较大（>100Kb），提取出来的质粒要用水或者TE溶解，所使用的液体量是溶解常规质粒（5kb左右）体积的2倍，这样定量结果才准确。我提取的质粒OD260/OD280=2.0左右，说明还是比较纯的。（一般10ml菌液提取的bacmid 用150-180ul液体来溶解。）

另外，你没有使用pFastBacHTCAT作对照吗？若这个也不行，可能是你的转染试剂有问题。