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标题:【求助】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统...

ffaa[使用道具]
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发表于 2013-5-11 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.构建好穿梭质粒后，有没有测序证实序列的正确性呢？因为一直没有看到coffejumps 提到读框的正确性问题;

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这也是一个问题，其实我在同时做四段目的基因的表达，虽然都进行了测序，但仅有两个是可以测出并核实正确的。其它两个经过反复测序提供了质粒、菌液（而且试了两家公司），但公司的回复是有复杂结构，信号有干扰，无法正常测序。

但是目前免疫荧光的结果是同时几个都为阳性（当然绝对是做了阴性对照的），我想这个结果是可靠的。毕竟测序正确并且荧光检测阳性的结果是有的，说明构建质粒不可能都存在问题。

我也想弄清楚究竟测序中的复杂结构，是不是会影响蛋白表达，实验进行中……
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发表于 2013-5-11 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2.抗体是针对WB还是细胞免疫荧光？还是WB更为特异;

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我说过我们只有抗血清，效价不高，故免疫印迹无法正常检测，由于是使用DAB显色而非曝光，所以检测灵敏度是低于免疫荧光的。

由于同时进行了正常细胞和无关细胞、抗血清和无关抗体的多种对照，我想免疫荧光的特异性还是可以肯定的。
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发表于 2013-5-11 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
3.High five细胞的表达量是最高的。

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同意，至少protocol是这么说的，故这也是下步的实验重点。
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发表于 2013-5-11 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
感染
刚才看到这些贴子，我也是做这个的。表达了几个蛋白，觉得这个系统的表达很subtle。有些蛋白就那么好表达，有些就怎么也弄不出来。因而经常去生化所吴老师组去讨教，了解了一些，与大家分享、讨论。

不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。很佩服你，用BamH I和EcoR I来做Hta。这两个酶靠得很近，我有好几次想用他俩（酶的效率比较高），都没敢用，怕切不彻底。His Tag不应该会被包在内部，因为一般做的蛋白质电泳应该是变性胶吧。

另外，我觉得转染前后不应该更换培基种类，那样会影响细胞状态的。我在做转染的时候只将FBS去除，protocol上说血清中的成分会对脂质体包埋DNA有影响，其他添加剂的影响应该不大吧。Grace’s培养基属于基础培养基，对这两株细胞（SF9 & High Five）都不是最适培基。sf细胞株以前使用Gibco的TC100，后来停产了，选用他们的SFM 900II，虽然说是无血清培基，我们还是加了10%的FBS。High Five 应该也有与它相适应的培基，好象是Express Five SFM。SF细胞适于悬浮培养，High Five好像偏向贴壁表达。

我在做转染前，细胞通常贴壁过夜（让它适应一下），至少也要贴壁两个小时以上。转染后用封口膜将dish封闭放置四到五天（比说明书上的时间长）。扩毒的时间也比说明书上的时间长（视细胞状态，通常也是四到五天）。这样细胞向培基中释放出的病毒能多一些。我们这边有人做表达的时候，竟然染毒后一星期收细胞，见到她的蛋白表达那么大一坨！汗~~

免贵姓何：我们也采用手抽Bacmid，试剂盒贵了些吧。在solution I中加入RNAse A，结果没见到很多的RNA呀。Help质粒是有的，不大影响转染。

再发表一些我自己的愚见：转染效率不高对收获病毒影响很大么？只要有Bacmid DNA进入细胞，她不就能释放出来有感染活性的病毒么？不就可以感染周围的细胞么？比较蠢的想法。
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发表于 2013-5-11 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
图中已经成功纯化的蛋白是病毒结构蛋白，非糖蛋白。这次表达量比较高，sf9和highfive细胞中均有较高的表达量，不过这次的纯化工作都是用highfive细胞完成的，感觉纯化比较简单。

另外有个糖蛋白也成功进行了表达，但是表达量不高（不过好歹SDS-PAGE可以看到了），纯化过程也遇到了麻烦，发现同样的条件，根本不合Ni-NTA珠结合，条件还在摸，估计该糖蛋白经过糖基化修饰，折叠，his-tag被阻挡。郁闷ing!

小结一下：目前的实验结果说明上述的实验方法没有问题，大家可以放心参考！
证明免疫荧光阳性的结果是可信的，只是细胞表达量很低。
前段时间开了个会，同一位老师交流了一下，他说他的一个蛋白也是表达量很低，每次纯化要培养大概100多毫升细胞，才能纯化出一点蛋白。
所以该表达系统也不是万能的，虽然该系统是真核表达，但针对不同的蛋白，其表达量可有10-1000倍的差异，大家选用之前一定要想好。
病毒空斑试验不做可以，但是由于不能确定病毒液的滴度，会影响表达量，但决不会影响表达


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 小中大
不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。很佩服你，用BamH I和EcoR I来做Hta。这两个酶靠得很近，我有好几次想用他俩（酶的效率比较高），都没敢用，怕切不彻底。

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我目前纯化出来的这个蛋白，表达量大约在2-3mg/1*10^8个细胞，还不是很满意。呵呵，这两个酶的效率比较高，放心用！反正后面要鉴定嘛
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mickeylin[使用道具]
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 小中大
我在做转染前，细胞通常贴壁过夜（让它适应一下），至少也要贴壁两个小时以上。转染后用封口膜将dish封闭放置四到五天（比说明书上的时间长）。扩毒的时间也比说明书上的时间长（视细胞状态，通常也是四到五天）。这样细胞向培基中释放出的病毒能多一些。我们这边有人做表达的时候，竟然染毒后一星期收细胞，见到她的蛋白表达那么大一坨！汗~~

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这个状态怎么控制？谈谈你的经验如何？
放一个星期都可以？？？晕！细胞破裂死亡不会导致表达蛋白降解吗？
你们通常都表达什么性质的蛋白，稳定性如何，表达膜蛋白成功的例子多么？
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 小中大

相关疾病：
感染头痛
个人认为没有必要太拘泥于转染效率的问题. 其实如果严格按照protocol来做的话,一般都会得到可以的转染. 偶用普通的miniprep kit来提取Bacmid,浓度通常比较低,但是量是足够做转染了,所以偶也不太care啦. 转染效率低的话,后果就是P1的滴度低.但是这没关系,因为偶从未指望用P1来做什么实验. 在P1的基础上继续扩增P2,P3, 偶一般是感染4,5天后收集上清. P3的滴度都能达到10^8.

在使用这个系统中,偶感到最为头疼的是培养sf-9细胞. 细胞状态老是不好. 传代的时候用一般的移液管根本就把细胞吹不下来. 换巴斯德细玻管也得费老半天劲才能下来,下来的细胞估计是受到创伤,状态总是不太好. 不知众位站友是怎么做的?
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 小中大
在使用这个系统中,偶感到最为头疼的是培养sf-9细胞. 细胞状态老是不好. 传代的时候用一般的移液管根本就把细胞吹不下来. 换巴斯德细玻管也得费老半天劲才能下来,下来的细胞估计是受到创伤,状态总是不太好. 不知众位站友是怎么做的?

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细胞状态不好？还贴壁这么牢？

我们使用10%胎牛血清的Grance全培，细胞状态很好，但是也是贴壁很牢，我们一直使用胰酶消化，效果 不错，好像对结果没有影响，对细胞状态也没有影响。
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发表于 2013-5-11 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞状态不好的时候,当然是飘起来的. 本来状态很好,费老劲搞下来传代以后,好多就飘起来啦. 每次就只好让它贴一小时,再扔掉不贴的. 浪费偶好多细胞.
可以用胰酶消化吗? 偶试过一次,没下来,就再没试过.可以说说你用胰酶的浓度和时间吗? 谢谢楼上的兄弟.
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