小中大不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。
==========================================================================================================
深表赞同啊，我就是用bac-to-bac系统表达膜蛋白的，作了一年。一开始也是前面的步骤都没问题，就是最后的western做不出来，一直以为是序列有移码，测序存在问题。反反复复测了很多次结果都不一样，汗啊～～后来才发现是蛋白表达量太低，western没有检测到（因为当时的阳性对照是一直以为表达量应该差不多的蛋白，结果哪知道差那么多！）。最近提高一抗的稀释度4倍，就检测到了，提膜蛋白做纯度就更高了。
这么做下来，也是觉得，转染纯度什么的都不是问题，有的话就可以了。我们也是手工提的。至于细胞状态，我们用的是sf9细胞，一般过夜就一定能贴壁的不错，传代的时候就用吹管吹下就下来了，很容易，不需要用消化液消化的，而且我记得sf9好像应该是半贴壁细胞吧？？
感染的迹象：做病毒P1扩增的时候，不是很明显的，也就是细胞一开始还是长的，后来停住，变大变透明的感觉。如果是用高滴度病毒做表达的时候，好的情况（国外一位老师说）应该是像“气球”一样浮起来，然后变大变通透，如果是有要裂掉的那个样子我觉得是养的太久了吧。一般我作的话，病毒扩增都是3天的，表达4天，如果真要表达7天，我在想是不是蛋白都要被水解光了？
感觉做滴度是最麻烦最费时间的事情，很容易污染，不知道大家是不是这样的？要么就是一个噬斑都没，反正成功率不高。但觉得病毒滴度对优化表达条件提高蛋白表达量又是很重要的，不知道有没有什么好建议或是做的好的同志的心得，可以分享一下？那天有看到基因公司在代理BD的滴度测定试剂盒（BacPAK rapid titer kit），2天就可以测完，就是太贵，3700RMB就没几次好用，奢侈啊～～
