蛋白质与蛋白组学

我也在用昆虫细胞sf9和baculovirus表达一个蛋白， 蛋白要么是不合histag结合， 要么是没有活力。 试验室里的人说我表达的是分泌型蛋白，他们只用细胞培养上清做分离纯化，可我怀疑上清中蛋白不够多，也许大部分都在细胞里，怎么确定蛋白是分泌表达还是胞浆表达呢， 是不是是由蛋白本身的特性决定的。 另外我对你的纯化过程非常感兴趣，我最近对一个蛋白进行了几次纯化， 过了histag 的bead,还是有很多条带，能不能介绍介绍纯化过程，非常感谢。

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分泌性表达是会分泌到上清之中的，所以你检测到上清中有蛋白，就是分泌表达了，如果表达量低，你可以试着将上清浓缩。

杆状病毒表达的蛋白比较奇怪，有的很好纯化，有的很难，就是不和Ni-珠结合。可能是因为膜蛋白经表达修饰影响了histag的结合位点。但是如果你的蛋白可以结合，但是有杂带，你可以试着提高wash buffer 中咪唑的浓度，这样可以洗掉杂蛋白，当然随着咪唑浓度的提高，目的蛋白可能也会有一定的损失。

我是用Baculogold 来做蛋白表达的，做了一年多了，始终没有检测的到，细胞是sf9。

我的蛋白是膜蛋白，140kD，国外都表达出来了，但是我用我自己构建的病毒来做，怎么都没有做出来，听说膜蛋白很难表达，我想到底是什么问题？表达量文献上的很高，而我的western 都基本上看不出来。

我所怀疑的各个步骤都没有问题，包括病毒都是由感染性的，MOI试过n多次，我每次感染都是在72h或更长时间，后收细胞的，细胞病变很明显，对于这么大的蛋白，是不是时间短了阿，

不过在细胞的培养方面还是有很多经验的，希望和大家交流，也希望大家能在蛋白表达这方面给我指导，郁闷中

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建议你用RT-PCR鉴定一下是否有转录，排除序列及质粒构建的原因

还有，sf9的细胞电泳，你们都是怎么处理细胞的？
我的细胞量不是很多，如果提膜来检测膜蛋白的话，就很少了，我试过跑全细胞电泳，但是结果考染后整条带都兰呼呼的，而且带形很难看，不知道是由于脂太多，还是由于核算的干扰？

你们都是怎么处理细胞的，来检测蛋白的？

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关于sf9细胞的处理，我提供一种方法：

可以用PH8.0 20mM Tris-HCl 2%triton X-100裂解细胞（RT, 30min, 有条件加入蛋白酶抑制剂），分别取裂解的上清和剩下的细胞沉渣（以适当盐水重悬，取混悬液）进行电泳鉴定。

效果会好一些。

您好，我也是用该系统表达纯化蛋白，现在出现的问题是破胞后，我所需的目的蛋白大部分都在离心后的沉淀里，用了Ni-NTA柱洗脱后，跑PAGE胶，基本上就看不到目的条带，在全裂解液和沉淀里条带特别浓，我想请教一下，这是怎么回事，是不是裂解液的PH不对，还有盐浓度是不是有问题？

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这个要看你表达的蛋白，可能本身结构的问题无法溶解；或者裂解液条件过于剧烈使蛋白变性。