蛋白质与蛋白组学

我最近也在用这个系统表达蛋白，我想请教各位师兄，你们大概用多少细胞裂解上样跑SDS-PAGE？
　　我之前用２５CM２的培养瓶，收集一瓶的细胞用４００ul的裂解液裂解后，取上清用２X的上样液上样，可是跑胶后，大分子量的蛋白可见，下面小分子的蛋白不可见，我在同一块胶上用细胞裂解碎片跑电泳下面的小分子量部分可见，但我不能确定这就是我要的蛋白．是不是用裂解上清跑出来才能确定我的蛋白啊？
我想是不是说明我的上清中蛋白量很少，所以我的胶上才跑不出来呢？我应该怎样优化条件呢？
　　要多少的细胞裂解才够呢？我想增加裂解的细胞量，又怕裂解液不能完全裂解，另外用细胞超声时，怎样的状态说明细胞已经超声好了呢？
　　我是新手，渴望得到各位有经验的师兄指点迷津？

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我做得一般都是1×10^6细胞，直接用100ul ２XSDS上样buffer重悬，直接跑胶（无需先裂解，电泳结果有目的蛋白再考虑如何裂解，如何纯化）

对于电泳结果无法判断的，建议做western blot来确定是否为目的蛋白及其相应的分子量。

如果选用超声破碎，可以在显微镜下观察，找不到完整细胞，超声就可以了。

请教一个问题,我前面做个两个蛋白的表达,可是第三个蛋白却出现这样的问题:1.以前是用SF9包装病毒,现在换用TN细胞,是不是对病毒包装有影响;2.包装的病毒感染TN细胞后,细胞提取RNA做RTPCR有强阳性,但western做了两次没有结果.是不是表达量太低;3.我用的TN细胞一直都用SF900II,感觉感染后细胞病变效应没有SF9明显,是不是一定要像说明书上说的感染前用10%FBS+GRACE培养基养细胞,感染后换用无血清的SF900II,希望得到大家的指点,谢谢

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当然，首先要考虑更换sf9细胞后，是否有影响，还是最好能做个sf9细胞对照。或者把你成功表达的这两个蛋白，在新的TN细胞中表达一下，确定是否是细胞的问题。

另外，目的蛋白的性质，重组Bacmid的纯度，可能都会有影响，在确定确有蛋白表达的情况下，最好做一下空斑纯化，再选用适合该蛋白表达的细胞系。

个人觉得培养基不会有很大影响（当然，除非对细胞状态有影响），后面更换的无血清培养基，主要是方便目的蛋白的纯化。

我也在做杆状病毒表达, 转染前测序证实序列和ORF没问题,SF9感染征象很明显,细胞免疫荧光约60%细胞阳性.但上清和细胞裂解液中WESTERN均测不到 目的蛋白,看完您所有帖子就想请教您一下,您是如何提高蛋白产量的?"这次表达量比较高，sf9和highfive细胞中均有较高的表达量" 经过怎样的改进达到的?我目前只有SF9细胞,以往用于制作裂解液的转染细胞大约传代40代左右,代数太多会是蛋白不分泌,胞内表达量也低的原因吗?急盼指点迷津!谢谢!

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sf9细胞养到30代以后，表达能力就会下降，建议30代以后的细胞就不要用了。

你只鉴定了细胞培养上清和裂解液？是否鉴定了裂解后的渣子中有没有蛋白？？？
你的蛋白很有可能以不溶的形式存在于渣子中。

所以建议不要先裂解，直接取细胞用上样buffer重悬，跑胶鉴定，先看是否有表达，接下来再考虑裂解、复性、纯化。

我在用sf21表达蛋白时，需要在细胞未病变，没有溶菌的情况下结束表达，让蛋白保留在胞浆中，请问这个过程该怎么控制？一般需要多少时间，而不让蛋白因为破菌分泌到培养液中呢？
另外，培养结束收集细胞的离心条件是1怎样的？1000g，10min会不会离破细胞？
有没有做过超声破菌的高手，请问条件是怎样的？这个一直没有查到很准确的资料。
谢谢，请指点

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首先想说，并不是在sf21细胞中表达的蛋白都会分泌表达的，所以对于有些蛋白，它就是胞浆内表达的，你就不用考虑怎么控制了。
对于分泌表达的蛋白，除了对基因进行改造，可能控值表达时间，也许有用。
一般细胞在400g以内离心是不会有事的，1000g，细胞很有可能裂解。

超声条件对于不同的仪器，功率可能不同，原则是在降低发热量，保证蛋白稳定的情况下，选用合适的功率。脉冲一般是超声5秒，停5-10秒，总共超声10次左右，镜下观察是否存在完整的细胞来判断超声的程度。