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标题:【求助】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统...

misswu61[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
白血病淋巴瘤

谢谢指点，我做过裂解物沉淀SDS-PAGE,没有与重链轻链对应的条带，上清也没有（我用的是分泌型载体）。但细胞裂解液至少有相对应的条带。现在复苏20余代的细胞准备重新表达（我拿来的细胞已经20代），并加做空白对照，准备再做SDS-PAGE和WESTERN。我的载体启动子是P10和Polyhedrin，请问这两个启动子能在哺乳动物细胞中起作用吗？我想试着在CHO细胞中表达。不知哪里可以买到HIGH 5细胞或低传代的SF9细胞？我们实验室有多种白血病和淋巴瘤及神经母细胞瘤细胞系，如果有战友愿意交换也可以。
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jujuba[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在invitrogen的protocal中写到关于摸索最佳MOI。他们给出的是几个值：1，2，5，10，20。现在假设最佳MOI=5（蛋白表达量最高）。可以说MOI=1时蛋白表达量应该是比较低的或者说不表达，那么MOI=10或者20时，蛋白表达量是比MOI=5时低呢还是说与MOI=5时蛋白表达量一样？有哪位做过这方面的，能不能给个图，看着直观一些。
再一个，大家的蛋白表达量一般为多少，比如说：10的6次方个细胞能产生多少蛋白？（很多因素影响表达量，各有各的差异，只想知道大家的蛋白表达量怎样，好用来参考一下）我的蛋白是分泌表达，带组氨酸标签，还有个问题：纯化对目的蛋白有没有损失？损失的量？
最佳收蛋白时间：假设蛋白在48小时才表达，在72 小时达到最高，那么在96小时蛋白表达量可能比72小时的低或者相同，120 小时的蛋白量应该降低，因为细胞裂解产生的酶将其降解（我在接毒后72小时以后细胞飘起来了将近一半）。这是我个人看法，因为我没有具体算过72小时后的蛋白量，我是在72小时收的。哪位具体算过？最好有个直观的图。谢谢！
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我目前在用终点稀释法测定重组杆状病毒的滴度，但96孔板接毒细胞只见裂解，但不脱落，不知是什么原因，是否96孔板细胞有特殊成分限制细胞及碎片脱落？另外，我想对两种重组病毒进行精确定量，不知选哪种方法更好，谢谢！
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发表于 2013-5-11 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好!现在我也用杆状病毒-昆虫细胞这个系统表达蛋白质,表达量也很低,请问你是怎样提高表达量的啊?十分感谢!!!
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loli[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我也正做杆状病毒表达，蛋白80多KD，不是分泌性的，细胞直接做WESTERN已经检出，但是无法在电泳中看见蛋白，请教如何改进能提高表达量，得到蛋白。谢谢帮助！
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idea2011[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么有病变,但是就是没有蛋白表达呢.
最近在用BAC-TO-BAC表达一个蛋白,大概180KD.以前师兄做过,现在再用到这个蛋白.一开始老板要求从新构建穿梭质粒,PCR鉴定成功,没有构建目的蛋白特异性引物.转染细胞有病变,P3后提蛋白,SDS-PAGE没有发现目的条带,WB也没有发现,后用师兄几年前做的病毒上清(-80保存)从新扩,再次感染,有病变,提蛋白仍然没有发现目的蛋白,敬请各位师兄帮我分析问题可能出在什么地方.
最起码我师兄以前用过的病毒上清不可能都框移啊.
多谢.
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我用bac-to-bac系统表达了一个病毒的结构蛋白，之前感觉表达量很高，可以用WB检测出来，但是最近又共表达了该蛋白和另一个蛋白，用间接免疫荧光可以检测到目的蛋白，但用WB就是做不出来（阳性对照有带），不知道怎么回事.希望有人给予解答，谢谢！
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也正在做杆状病毒的昆虫表达，我表达的蛋白大约60KD，用His单抗做WB的时候结果是阳性，但是SDS-PAGE分辨不出目的蛋白，在做蛋白纯化的时候由于用的是含牛血清Grace培养基，牛血清蛋白是68KD，跟我的目的蛋白差不了多少，而且我发现牛血清蛋白也能挂Ni柱，导致我的蛋白纯化结果很糟糕。现在正在尝试使用无血清培养基，改用传代较少的细胞，看看表达量能不能提高。我提蛋白的目的是为了做单克隆抗体，不知道这一步能不能克服。有做相关研究的大家经常交流一下！
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

急请教各位大侠：
是不是昆虫细胞传代次数太多了会影响蛋白表达？传代次数太多了会不会也影响转染啊？
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发表于 2013-5-11 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

向大虾们求助：

目前在做昆虫的杆状病毒蛋白表达，想要做空斑试验来检测病毒滴度。

请问在此试验中使用的是哪种琼脂糖？

有很多参考上是说，4%琼脂糖，但是不知道这个所谓的琼脂糖是否必须是特殊的低熔点的琼脂糖，考虑的是昆虫细胞生长的温度为27℃，而且不耐压。
如果您实验室曾经做过此试验，望告知你们所使用的琼脂糖是哪种？ 是低熔点的还是普通型的？

非常感谢！ 望能及时回复！
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