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标题:【求助】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统...

chenshuanhe[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在用杆状病毒体系表达蛋白（细胞是sf9），出现了明显的细胞病变，从SDS-PAGE看没有明显的表达，用anti-his tag的单克隆单体做western blot也没有出现，请问是什么原因呢，请高手指点
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veiwu[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问大家都是表达什么蛋白呢？有做植物蛋白的吗？
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chenshuanhe[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在用杆状病毒体系表达蛋白（细胞是sf9），出现了明显的细胞病变，从SDS-PAGE看没有明显的表达，用anti-his tag的单克隆单体做western blot也没有出现，请问是什么原因呢，请高手指点

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有时候P1，P2是检测不到自己的目的蛋白的。一般用P2做表达优化时，WB检测了就一目了然了。
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

P2-P6代病毒，病变都很明显，用His单抗做WB就是检测不到蛋白的表达，这蛋白是一截短的蛋白。
表达完整的蛋白，用His单抗做WB就可以检测到蛋白的表达了，但表达量很低。
为什么看到明显的病变而检测不到蛋白呢？
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发表于 2013-5-11 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

挑白斑后提取的rbacmid,只用外源基因本身的特异性引物做PCR能说明外源基因正确重组了么？
M13引物对太难扩出来了。
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发表于 2013-5-11 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有时候P1，P2是检测不到自己的目的蛋白的。一般用P2做表达优化时，WB检测了就一目了然了。

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表达优化要从何入手？
呵呵，问了一个比较泛的问题。
谢谢^-^
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好！还有人在做昆虫细胞表达吗？我现在做到表达阶段啦，SDS-PAGE电泳检测一直没目的蛋白呢，转染有病变产生。希望大家能讨论下，帮帮忙！十分感谢！
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qiangren789[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
感染
各位战友们：
我也是做昆虫细胞的感染表达实验的，但是我的感染后细胞病变不是很明显，我感染的时候没有加抗生素，但是6小时以后就又换成抗生素和FBS的培养基了，之前做过没有加抗生素，但是后来有污染，所以就加了抗生素，是不是抗生素对细胞感染有很大的影响呢？还有细胞在怎样的状态的时候感染效率是最高的？请各位战友们帮帮忙，谢谢！！！
还特别请问coffejumps
感染后上清浓度太低的话是怎么浓缩的呢？谢谢谢谢！
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们使用的胰酶过了有效期，浓度是0.5%（1640配制），一般0.25%就好了。消化很快呀（3-5min），你再试试。

You are welcome. Good luck!

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想请假下sf9和sf21哪个细胞更好一点儿？
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ffaa[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 duoduo 于 2013-5-11 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们使用的胰酶过了有效期，浓度是0.5%（1640配制），一般0.25%就好了。消化很快呀（3-5min），你再试试。

You are welcome. Good luck!

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想请假下sf9和sf21哪个细胞更好一点儿？ ...

最好都试一下，还有highfive细胞。哪种好就用哪个来表达，扩增病毒通常用sf9，高效表达通常用highfive。
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