小中大
算起来我做WESTERN也有一年了，中间经历了很多，下面我也来谈谈；
自己做了近100次wb，说下体会
1，样品：样本一定要好，也就是说造模型一定要严格控制条件，只有模型成功了才能有好的结果，否则后面即使WESTERN条带做得再好看也得不到好的趋势图。再次就是提蛋白，一定要注意在冰上操作，使用的裂解液我用过biyuntian的RIPA(强，中，弱）还有p0013b,c都用过，有时蛋白做不出来我一个样同时用好几种裂解液提蛋白，分别作western,看那种裂解液效果好，然后找到一个相对好的就一直用了。
2.定量：开始做western时每次都做BCA蛋白定量，后来发现做得曲线拟合度特别好，做完后内参还是不一致。后来干脆都不定量了，开始时对组织一定要称量，以前不称量发现有的发光后相差好几倍，所以一定要称量，这也相当于定量，使数量级一样。现在我基本上不定量，每次提完样先每个加5ul做一次内参，然后根据内参曝光结果再做微调。不过有时调2，3次还调不奇，最郁闷的是同样的上样量，今天做和明天做都不太一样。有时候一起跑的二块胶结果都不一样。所以得到一个一致的内参真是可遇不可求。可能是我的方法不成熟，或是westernt体系不稳定，欢迎大家指点如何调内参一致。
3，灌胶：用过博士德的AR0138很便宜，也很好用，也用过碧云天的配胶试剂盒，稍微比博士德贵点，康为世纪的相对很贵，300多，听说他们的定位是中国的abcam,定位为高端产品，质量不错，由于考虑价格，我还没用过，不过听别人说很不错，因为他们的东西都是用进口的。
4，上样，样品我现在一般煮10min,效果不错，用得是碧云天的5乘上样缓冲液
5，跑胶，理论上电压越小，分离得越好。我一般，浓缩80，分离120。也试过90，130，或者100V跑完全程，效果都可以，我觉得关键在于胶要配好，电泳液要配好。
6，转膜，半干转，湿转我都做过，由于湿转花的时间太长，我现在一般半干转，开始时我们科一般用恒压25v,30min做100KD，用得是0.45PVDF膜，但是特别容易转过，有时转20min都转过了，后来一次偶然的机会一个同学发现0.2um的PVDF转的效果特别好，转不过，后来我们就一直用0.2的了。为了摸转膜条件，我经常25V,分别转30min,45min.60min,75min，分别试分别染胶染膜看效果，也是过30v,35v恒压转30min,45min,50min,虽然伯乐半干转要求不能超过25V,但实际上超过了也没事，但就是转完后膜有一些发热。后来一次机会到别的科师姐那做半干转（她们用的是六一半干转），他们做了很多100以上的分子，都是横流，膜面积*5，做得都不错，我在我们科做130左右的蛋白一直做不好，那次用他们的转膜方法作出条带了，所以他别高兴，后来就一直用横流了，他们m膜面积*5用的是普通滤纸，我们用的是伯乐超厚滤纸，后来我在伯乐半干转上用普通滤纸，横流膜面积*5,50min,也能作出130左右的蛋白了，现在我又做了一些改进，用超厚滤纸，横流，膜面积*5,35min做100一下的蛋白，效果不错。三明治各层之间不要有起泡，
7，封闭，5%的脱脂或者3%的bsa ，我现在一般37°，90min,效果不错，背景很少，但背景与一抗好不好，洗膜等有关
8 孵育，有封口袋加静音混合器4度过夜摇法，以及膜倒扣法，有时想快点出结果，我试过一抗RT90,60min,都可以，但4°过夜效果好一些
9洗脱，一般6in*3次，PBST
10,显影，用的是伯乐的曝光系统，很方便The immunoblotting was visualized with ChemiDocXRS (Bio-Rad Laboratory, Hercules,CA
欢迎大家指正
