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标题:【讨论帖】western blotting试验技术讨论

rxcc33[使用道具]
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最近要做WB了,在提的胞核蛋白中要同时跑三种不同的蛋白,对于一抗的选择很是苦恼啊。我做大鼠的,已经订了一种一抗,是兔抗大鼠的,不知道另外两个能否也订兔抗大鼠的,那样就能用同一个二抗了。希望各位能多多指教。

显影后可以洗脱液把抗体洗掉,就可以再用不同的抗体孵育了。
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rxcc33[使用道具]
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ECL发光多长时间及其后显影和压片条件如何把握到X胶片最佳状态(背景浅、条带较深且体现出真实结果)?

在暗室中能够看到亮带,时间要短一点,一般1-2分钟,还有在显影液中也不能太久,不然显影出模糊的背景,然后根据第一张显影的结果再进行调整,是可以获得最佳的结果的。
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INK[使用道具]
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很羡慕楼上,弱信号仍能压出清晰的条带。我觉得我的条带荧光觉得已经比较强了,反而没有做出来,很是郁闷。
荧光淬灭的事情我很好奇。因为昨天做的好好的,突然拿镊子夹起来膜,把ECL液体用滤纸吸走的时候,突然发现条带看不见了。。。以前做没这样过哦。。不知道各位有没有遇到过类似的情况。
还有就是我买碧云天的东西,每瓶50ml,AB液,总共好像是285还是258。可能跟楼上的说的不完全一样。
谈谈我自己曝光的感觉。条带荧光强,压片的时间就相应缩短,我一般很强的就压30s,然后延长时间,条带很弱的话,就压片时间久点甚至压24个小时,呵呵,因为条件所限,没有暗室,只能每天晚上把PCR室占用了。。。

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有荧光却没有做出来,是因为荧光淬灭吗?如果不是那胶片是否曝光,显影剂是否失效呢?
你所提到的荧光淬灭我也遇到过,有时不小心将盖PVDF膜的保鲜膜掀起,荧光就会突然淬灭,而有时候即使将PVDF膜夹起,荧光也不会淬灭。我觉得可能还是跟二抗浓度,二抗与底物反应时间以及当时的反应条件有关。
我们用的发光剂是中杉金桥的,也是AB液,每瓶50ml,还不错
太佩服你的耐心了,24个小时也压过,强!
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any333[使用道具]
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在提取核蛋白时的DTT用水溶解还是用乙酸钠溶解,二者有什么区别吗,对提核蛋白有什么影响吗?
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wawa[使用道具]
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我最近的WB条带也是弯弯曲曲波浪状的,不知有什么办法可以改变这种情况?
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rxcc33[使用道具]
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请教各位大侠:Tween20稀释成20%的后4°能放多久啊?
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ukonptp[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 wawa 于 2013-5-14 13:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我最近的WB条带也是弯弯曲曲波浪状的,不知有什么办法可以改变这种情况?

我认为极有可能是胶的问题,因为不均匀或凝固不全或含有气泡等原因引起。建议配制胶时要充分混匀,且注意AP和TEMED的含量(与室温有关)。
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ALALA[使用道具]
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我正在准备做WESTERN,请师兄师姐们介绍一显影效果好又不贵的显影试剂盒。听说碧云天的效果不好,又不想太贵,请大家指点啊。
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plaa[使用道具]
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有哪位高手可以提供一下转膜时的选择标准,比如说:
小于10KDa的建议用多大的电压/电流转多长时间?
10-30KDa的建议用多大的电压/电流转多长时间
以此类推,有没有这样的标准或经验呢?
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zhezhe[使用道具]
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我们实验室用5%的脱脂牛奶稀释一抗,配的时候每一毫升抗体加10微升10%的叠氮钠,我们的一抗用好几个月(大约3个月)都可以,大家没有这么用的吗?
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