【讨论帖】western blotting试验技术讨论 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blotting试验技术讨论

鲇鱼少爷[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做核蛋白的有用GAPDH做内参的吗？

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有哪位高手可以提供一下转膜时的选择标准，比如说：
小于10KDa的建议用多大的电压/电流转多长时间？
10-30KDa的建议用多大的电压/电流转多长时间
以此类推，有没有这样的标准或经验呢？

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我也在学习中，我们做的Caspase-3，17~19KD，说说我们的条件：5%积层胶，12%分离胶，积层胶20mA稳流，跑至溴酚蓝呈一条直线，大约40分钟；分离胶120V稳压，一直到溴酚蓝将至玻璃板底部，大约1.5h。具体时间与电泳液的使用次数有关。
转膜用孔径0.22微米的PVDF膜，半干转，电压10V，转25min，转膜效果还不错。
30KD的Bcl-2，我们用0.45微米的膜，10V，25min。
40,60KD的ERK，AKT，0.45微米PVDF膜，10V,30min。

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室用5%的脱脂牛奶稀释一抗，配的时候每一毫升抗体加10微升10%的叠氮钠，我们的一抗用好几个月（大约3个月）都可以，大家没有这么用的吗？

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我们也这么用，我们稀释一抗用5%BSA，不过不加叠氮钠，毒性太大，有点怕。放在4度冰箱避免反复冻融，孵一抗也在4度冰箱孵，可以反复使用一个月。并且我觉得用过几次的抗体最好用，不知大家有没有这种感觉。

am10[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

压片心得：
一开始老是掌握不好，不过现在总结的经验是：
进去荧光很亮，三秒钟搞定
如果隐约可见，10秒钟
如果没看到，第一张片子30s一般都会压出条带，实在不行，第二张要3分钟数200下。
还有二抗是可以重复使用，以前不敢，不过试过了蛮好了哈哈，省钱啊。

XYZQ[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

实验心得:

1.如果采用过夜封闭方法，时间比较长，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜!

2.封闭时最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果!

3.转膜时的温度比较重要,最好保持在10度以下,可以用冰浴,也可以在转膜液中放入合适的事先准备的冰袋(-70度>3小时)(Bio-Rad),这样既可以降温又可以节约Buffer

我佛慈悲[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自己做了几十个wb，说下体会
1，样品：样品处理很重要，如果样品处理不好，导致目的蛋白丢失，你后面再怎么wb，也出不来结果，所以蛋白获得，这部非常重要。
2，灌胶：千万不要有杂质，这样你的带就容易微笑，灌胶加梳子后，可以再梳子上方再加点浓缩胶，这样可以减少胶凝后产生的塌陷
3，上样，样品得煮，而且loadingbuffer，也要配好，别出现颗粒，而且若有多余孔，得用loading buffer 补齐，要不带会往两边开
4，跑胶，理论上电压越小，分离得越好。我一般，浓缩80，分离120。根据实际情况而定吧，自己摸索。
5，转膜，我用的是半干转，剪裁的时候戴手套，不要摸膜，也不要用油性笔去做记号，裁滤纸，膜。三明治各层之间不要有起泡，
6，封闭，5%的脱脂或者3%的bsa ，室温两小时，或者浓度小点4度过夜
7，孵育，很重要的步骤，我一般将96孔板的盖子上面蒙层保鲜膜，再将膜放上去，然后直接将抗体滴在上面。一抗，二抗，比例得自己摸索，一般推荐比例内稀释。
8，洗脱，一般10min*3次，TBST
9，显影，做了上面这么多，就为了好的曝光结果，多花点心思，曝光多几张，你会有收获的，园里有曝光相关问题的帖子，大家搜索看
就这么多了，谁有好的拿出来分享吧

菠萝喵[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

比较一下western所用的几种膜特性及优缺点：NC膜尼龙膜 PVDF膜

附件

2013-5-14 13:25

51334328.snap.jpg (57.82 KB)

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

每次做出来都是微笑条带，为什么呢？

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教各位大侠：Tween20稀释成20%的后4°能放多久啊？

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像Tween20，TritonX100等非离子型去垢剂我们实验室均为室温储存，时间不超过2个月，时间久了就会失效的，切记！！！

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室用5%的脱脂牛奶稀释一抗，配的时候每一毫升抗体加10微升10%的叠氮钠，我们的一抗用好几个月（大约3个月）都可以，大家没有这么用的吗？

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如果要求较为严格的话，其实一抗配好后只可以使用一次的，因为会污染膜上脱落的小分子蛋白等，另外，抗体成分会随着杂交次数的增加而变化，因为PVDF膜以及膜上转移的蛋白会非特异地吸附很多抗体成分，还有就是抗体自身会发生一定程度的降解。

我们室通常使用抗体2-5次就更换（第一次通常背景较高），最好不超过1个月

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