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标题:【讨论帖】western blotting试验技术讨论

bananapeople[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和
免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质
按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物
上， 用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白转移的方法多用电泳转移 （转移电泳） ，它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间
接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶
（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显
色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于
蛋白表达水平的检测中。
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鸽子不哭[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主好啊：
我是做WB的新手，最近做的几次，目的蛋白条带不是所有样品孔都会发光，一般九个条带只有四五个会亮，把膜做了丽春红染色没问题，同一张膜做了内参也没问题，不知是怎么回事啊！在线坐等楼主的指点！！！
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969[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我上的样品在堆积胶里压不成一条线，只有加大电压后在分离胶才能压成一条，这是为什么呢请高人指点！
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电泳和转膜都没有问题，可是就是显色不行，不知道为什么，试剂也都重新换过了。可是还是不行，不知道哪位有高见啊！！！急急急急！！！1
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发表于 2013-5-14 13:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我只想说两个问题

一.Western blot 结果做的好不好,转印这关很重要,转印液最好现配,或在一定时间内更换,因为里面的含有甲醇,还是容易挥发的.

二.显色,除了一抗二抗比例匹配之外,AP标记的二抗,要用AP显影液,我主要想说的是此是膜用NC膜比较好,条带更为清晰,HRP标记的二抗,要用ECL显影液,不推荐用DAB显色的方式,DAB显色主要用在ELISA上比较合适.AP显色时间不宜过长,否则背景会比较深
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发表于 2013-5-14 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1-4为样品泳道，5为加样缓冲液做的对照，其中无蛋白样品，但是在做杂交的时候却有条带产生， ，做了多次都是这样的很困惑，希望高人指点。（能保证加样缓冲液没有被蛋白污染）


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发表于 2013-5-14 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
条带怎么会这样的呀，中间少，两边粗


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发表于 2013-5-14 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现在做b-actin出现怪异现象，总是在55kd和43kd出现条带。这个b-acitn，我实验室其他人用时只出现在43kd的。有没有人碰到过这种情况，是什么原因造成的。
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@花开花落@[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有两个相差1kD的目的蛋白（假设为a,b），二抗均为抗羊，先杂a再杂b的话，b的条带很弱但是a的条带还很强，先杂b再杂a则a的条带会很弱，总之二抗会累积而且很难洗掉一样，我试着增加一抗浓度，降低二抗浓度，结果好一些但仍然不够理想。用洗膜液洗了之后，残留的抗体是没了但是蛋白好像也被洗掉了。急求各位大侠帮忙。
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dreaming[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

3、电泳
从历届师兄以及个人实验，我觉得蛋白样品在浓缩胶时的电压为80V，时间为20min左右，在分离胶时可以提升到110V，直至溴酚蓝将抛出为止，整个电泳时间大概在120min左右，当然分离胶浓度不同的话时间会有所差别。
4、转膜
多次的实验摸索让我对转膜颇有心得。有条件的话最好用新鲜配制的转移缓冲液，最好不要超过三次，否则缓冲液的成分发生改变，你用同样的转膜条件就不一定能有一样好的转膜效果了。个人觉得似乎恒压转膜要强于恒流转膜，虽然有人说采用恒压转膜可能会因为甲醇的挥发导致电流不平稳，不利于转膜，但我采用恒压效果还是相当不错的。
转膜时间有没有什么好的建议
我做的是92KD及44KD左右的蛋白
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