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标题:【分享帖】秀出你的western转膜条件

PCR[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我看各位转膜都用了好长的时间，invitrogen的iBlot把转膜时间大大的缩短了（7到10分钟），就是有点贵啊。本实验室也在研制快速转膜的仪器，现在40-100KD的蛋白7到10分钟也可以转过去，不过现在实验条件还在优化，明年初应该就可以上市了，希望可以帮助各位缩短实验的时间！
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：脑组织
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：16KD、27KD、32KD、42KD
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22um
转膜方式（恒压、恒流）：半干转 恒流 1mA/cm2或2mA/cm2
转膜时间：不定
转膜设备: 北京六一仪器

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：
我共做了六个蛋白，所以总在想节约时间的方式。
在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系，所以我不会按时间来定何时转完，而是按电压来定。通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。这样有的5分钟就转完了，不用多浪费时间。并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多，效率也会下降，所以时间和转膜效率（尤其是使用后期）的关系并不稳定，单纯依靠时间有时会有问题。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：CHO cell
蛋白名称（可保密）：酶原
蛋白分子量：40KD
WB用膜类型、孔径：0.22的PVDF膜（Biorad）
转膜方式（恒压）：100V，湿转，转膜时间: 60min。
设备：Tanon（上海天能）
建议：
1.  转膜液现用现配，用完倒掉。
2.  转膜时间，电压可以适当调整。分子量大或者小一些的蛋白，采用此条件一样转膜效率很高。
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：Hepg2
蛋白名称（可保密）：EGFR
蛋白分子量：170kd
WB用膜类型、孔径：pvdf 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：24V
转膜时间：2个半小时
转膜设备:伯乐半干转

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：半干转转大分子量没有湿转好，200KD以上的还是建议湿转
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白来源：肝癌细胞
蛋白名称：HIF-1α
蛋白分子量：120kD
WB用膜类型、孔径：NC膜
转膜方式（恒压）：80伏，湿转，转膜时间: 150分钟
设备：“Bio-Rad mini”
建议：湿转，转膜液特别重要，否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用，不重复利用。转膜时间一般是150分钟，80伏恒压。经李春红染色，靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深，膜另外一面染色浅，说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围;170-36kD。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：心肌细胞总和膜
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：128KD，100，60，55，43KD
WB用膜类型、孔径：NC膜 0.2um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：70V 200min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
建议：转膜液最好现配现现用，或配成母液，最好不重复使用，70V电压下，电流约154mA。甲醇可以加到150ml。对大分子量如200KD转膜时间延长6-8h。
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发表于 2013-5-16 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：肺脏
蛋白名称（可保密）：ICAM-1
蛋白分子量：85~110KD
WB用膜类型、孔径：0.22NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 300mA
转膜时间：120min
设备名字 Bio-Rad mini
一抗用的santa cruz 1mL包装的。 比例调整到1：800做出很好的条带。
效价会一直降低的。去年做的这个指标，今年夏天做就不行了。
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发表于 2013-5-16 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：16KDa
WB用膜类型、孔径：0.2um PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：0.2A恒流
转膜时间：65 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：28KDa
WB用膜类型、孔径：0.2umPVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：0.25A恒流
转膜时间：60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
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发表于 2013-5-16 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白来源：人肿瘤细胞
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：80KD
WB用膜类型、孔径：0.45um PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：半干转移系统 恒流，勿超过0.85 mA/cm*2，同时转多张膜电流需累加（串联）
转膜时间：60-90min
设备：Bio-Rad

其实有些东西并不是非常严格的，要转移的目的蛋白分子量小，那么转移的时间就短一些，反之，则长一点；蛋白量充足，可以多转一会，蛋白量较少，则要少转一下，免得蛋白穿膜而过到了滤纸上而前功尽弃。
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发表于 2013-5-16 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：人和鼠肝癌细胞总蛋白、胞浆、胞核蛋白
蛋白名称（可保密）：***
蛋白分子量：17--116kd
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒流 200mA
转膜时间：3h
转膜设备:湿转 北京六一 24D mini
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